第7章酶的定向进化-精品PPT课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
➢ 操作手段：１）降低氯化镁的浓度 ２）是添加氯化锰 ３）是降低其中某一种单核苷酸的浓度或者用核
苷酸三磷酸盐类似物替代其中一种单核苷酸 ➢ 关键：选择适当的突变频率 ➢ 优点：快速、简便、操作方便 ➢ 缺点：它比较费力耗时,一般适用于较小的基因片段( < 800bp）
二 DNA改组（DNA Shuffling)
➢ 原理：用PCR 同时扩增多个 拟重组的模板序列时,在热循 环中大大缩短退火与聚合酶 催化延伸的时间 。
➢ 优点：多样性，操作简单， 无需片段纯化，重组发生在 单一试管中
➢ 缺点：依赖于序列同源性， 目的基因特异性的PCR条件 优化耗时
改进 2 随机引导重组(RPR)
➢ 1998 年, Arnold ➢ 原理：用随机序列的引物来产生互补于模板序列不同部分的
第七章 酶的定向进化
内容
➢ 概述 ➢ 定向进化的特点 ➢ 突变技术 ➢ 筛选技术 ➢ 定向进化的应用
概述
天然酶应用过程中出现问题（改造动机）
1 天然酶的稳定性差、活性低使催化水平很低、 缺乏有商业价值的催化功能； 2 越来越多的情况需要一些酶催化很多在自然界 中并不存在的各种底物来完成特定的反应过程 根源:
天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。而自然 的酶只能满足自然界中生命体（而非人类社会） 的需要
原始祖先
新物种 （地理隔离、生殖隔离）
（定向自然选择） （不定向变异）
新物种
实验室进化
随机突变+定向选择＝目标突变体
诱发突变的 因素
最适生长温度提高了！
细菌
最适生长温度为 370C
突变体库
50 0C培养
理性设计
➢ 两种方法打通了结构到功能关系，通过结构预测 功能或通过功能了解结构，使人类对蛋白结构和 功能关系有了更深入的了解，因此成为蛋白工程 的两样有力工具
➢ 因为通过定点突变可以向序列中引入关键残基和 结构元件,从而在定向进化中增加有益突变重组的 频率。另外,定向进化增加了理性设计知识,从而减 少了随机突变的序列空间,甚至为理性蛋白质设计 提供突变目标
大量的DNA 小片段 。 ➢ 主要优点：
1) 合成的随机引物长度一致并缺乏序列的偏向性（不要求 等位）, 保证了点突变和交换在全长的后代基因中的随机 性。
2) 随机引导的DNA 合成不受DNA 模板长度的影响, 有利 于小肽的改造。
三 基因家族重排技术
➢ 该重排技术和DNA重排 技术大致相同。
➢ 区别在于基因家族重排 所用同源基因重排，而 后者使用重同一基因易 错pCR获得的点突变进 行重排。
选择压力 （温度）
温度耐受型突 变体
定向进化:对特定基因直接突变+定向选择
定向进化的基本过程
第一节 定向进化的特点
一 适合范围广 不同于理性设计，要求事先了解酶蛋白结构
二 目的性强 突变针对特定基因定向进行 筛选针对特定功能进行，如热稳定性
三 效果显著 短时间完成酶在自然界中几千年进化历程，且
➢延伸－基因家族改组(DNA family shuffling):目的基因由单一 基因发展为相关基因家族或一组有利突变体,要求基因家族有一 定程度上的同源性。基因家族改组使改组效率提高并相应提高 基因多样性．
体 外 定 向 进 化
改进1：交错延伸技术(StEP)
➢ 1998 年, Arnold 等人又建立 了一种新的体外重组方法交 错延伸技术。
➢1994，Stemmer等首次提出体外重组技术，又称有性 PCR(sexual PCR) 、或分子杂交(moleular breeding)
✓优点：以用重组的方法将存在于许多突变体当中的有益突变 快速积累，可以删除个体中的有害突变和中性突变． ✓缺点：改组过程中伴随的较高点突变频率会严重阻碍正突变 组合的发现。
PCR反应循环
Βιβλιοθήκη Baidu
94℃
55℃
72℃
变性-提供单链模板
延伸-高效聚合核苷酸
退火-接上杂交引物
PCR循环
引物
5’
3’
3’
5’
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
PCR的指数扩增（2n）
一 易错PCR（error-prone PCR)
➢ 原理:通过降低传统PCR中一种或者两种dATP dGTP dCTP dTTaqTDPN的A浓聚度合并酶且。加使入基一因定在量扩的增M时n能Cl随2，机同的时创采造用突低变保。真遗度传的 变化只发生在单一分子内部,故属于无性进化(asexual evolution)
第二节 基因的突变技术
➢ PCR技术介绍
多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction)
PCR是由美国科学家穆利斯提出 的一种体外简化条件下模拟DNA体 内复制的DNA快速扩增的方法，此 技术获得1993年诺贝尔化学奖。
体内DNA的复制体系
5’ 3’
拓扑异构酶 解旋酶类 SSB
➢ 同源性高，获得杂合体 几率低
第三节定向进化的筛选技术
➢ 在定向进化中尽管突变体具有随机性，但通过选 择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实 验条件限制突变种类降低突变率缩小突变库的容 量，不仅减少了工作量更重要的是加快了酶在某 一方向的进化速度。
手段: 高通量筛选体系和超高通量筛选体系建立。 （对比以前的挑单菌落摇瓶复筛，筛选数目多， 试剂少，信号灵敏，自动化程度较高）
进化方向符合人类社会需求。
理性设计与非理性设计的对比
➢ 理性设计（定点突变，杂合） 对蛋白结构和功能关系比较清楚，设计一定蛋白结构（如 一级结构的氨基酸序列）来改变蛋白功能
➢ 非理性设计（定向进化） 无需知道蛋白结构和功能关系，直接筛选适合（催化）功 能的蛋白酶，再了解这些高活力酶蛋白对应的结构
➢ 半理性设计(semi-rational design)结合了两种方法的优点， 它在定向进化的基础上加入了理性设计的元素，将随机突 变限制在一个或几个残基上，可以有效的在一个较小的突 变库中获得性质改善的突变体，可以大大提高获得阳性突 变体的几率
DNA聚合酶（I II III）
引物 dNTP Mg2+
Mullis的PCR构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
模板：DNA 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 反应缓冲液 辅助因子：Mg2+
PCR反应体 系
Taq
P2
Mg2+
P1 dATP
dCTP
dTTP dGTP
苷酸三磷酸盐类似物替代其中一种单核苷酸 ➢ 关键：选择适当的突变频率 ➢ 优点：快速、简便、操作方便 ➢ 缺点：它比较费力耗时,一般适用于较小的基因片段( < 800bp）
二 DNA改组（DNA Shuffling)
➢ 原理：用PCR 同时扩增多个 拟重组的模板序列时,在热循 环中大大缩短退火与聚合酶 催化延伸的时间 。
➢ 优点：多样性，操作简单， 无需片段纯化，重组发生在 单一试管中
➢ 缺点：依赖于序列同源性， 目的基因特异性的PCR条件 优化耗时
改进 2 随机引导重组(RPR)
➢ 1998 年, Arnold ➢ 原理：用随机序列的引物来产生互补于模板序列不同部分的
第七章 酶的定向进化
内容
➢ 概述 ➢ 定向进化的特点 ➢ 突变技术 ➢ 筛选技术 ➢ 定向进化的应用
概述
天然酶应用过程中出现问题（改造动机）
1 天然酶的稳定性差、活性低使催化水平很低、 缺乏有商业价值的催化功能； 2 越来越多的情况需要一些酶催化很多在自然界 中并不存在的各种底物来完成特定的反应过程 根源:
天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。而自然 的酶只能满足自然界中生命体（而非人类社会） 的需要
原始祖先
新物种 （地理隔离、生殖隔离）
（定向自然选择） （不定向变异）
新物种
实验室进化
随机突变+定向选择＝目标突变体
诱发突变的 因素
最适生长温度提高了！
细菌
最适生长温度为 370C
突变体库
50 0C培养
理性设计
➢ 两种方法打通了结构到功能关系，通过结构预测 功能或通过功能了解结构，使人类对蛋白结构和 功能关系有了更深入的了解，因此成为蛋白工程 的两样有力工具
➢ 因为通过定点突变可以向序列中引入关键残基和 结构元件,从而在定向进化中增加有益突变重组的 频率。另外,定向进化增加了理性设计知识,从而减 少了随机突变的序列空间,甚至为理性蛋白质设计 提供突变目标
大量的DNA 小片段 。 ➢ 主要优点：
1) 合成的随机引物长度一致并缺乏序列的偏向性（不要求 等位）, 保证了点突变和交换在全长的后代基因中的随机 性。
2) 随机引导的DNA 合成不受DNA 模板长度的影响, 有利 于小肽的改造。
三 基因家族重排技术
➢ 该重排技术和DNA重排 技术大致相同。
➢ 区别在于基因家族重排 所用同源基因重排，而 后者使用重同一基因易 错pCR获得的点突变进 行重排。
选择压力 （温度）
温度耐受型突 变体
定向进化:对特定基因直接突变+定向选择
定向进化的基本过程
第一节 定向进化的特点
一 适合范围广 不同于理性设计，要求事先了解酶蛋白结构
二 目的性强 突变针对特定基因定向进行 筛选针对特定功能进行，如热稳定性
三 效果显著 短时间完成酶在自然界中几千年进化历程，且
➢延伸－基因家族改组(DNA family shuffling):目的基因由单一 基因发展为相关基因家族或一组有利突变体,要求基因家族有一 定程度上的同源性。基因家族改组使改组效率提高并相应提高 基因多样性．
体 外 定 向 进 化
改进1：交错延伸技术(StEP)
➢ 1998 年, Arnold 等人又建立 了一种新的体外重组方法交 错延伸技术。
➢1994，Stemmer等首次提出体外重组技术，又称有性 PCR(sexual PCR) 、或分子杂交(moleular breeding)
✓优点：以用重组的方法将存在于许多突变体当中的有益突变 快速积累，可以删除个体中的有害突变和中性突变． ✓缺点：改组过程中伴随的较高点突变频率会严重阻碍正突变 组合的发现。
PCR反应循环
Βιβλιοθήκη Baidu
94℃
55℃
72℃
变性-提供单链模板
延伸-高效聚合核苷酸
退火-接上杂交引物
PCR循环
引物
5’
3’
3’
5’
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
PCR的指数扩增（2n）
一 易错PCR（error-prone PCR)
➢ 原理:通过降低传统PCR中一种或者两种dATP dGTP dCTP dTTaqTDPN的A浓聚度合并酶且。加使入基一因定在量扩的增M时n能Cl随2，机同的时创采造用突低变保。真遗度传的 变化只发生在单一分子内部,故属于无性进化(asexual evolution)
第二节 基因的突变技术
➢ PCR技术介绍
多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction)
PCR是由美国科学家穆利斯提出 的一种体外简化条件下模拟DNA体 内复制的DNA快速扩增的方法，此 技术获得1993年诺贝尔化学奖。
体内DNA的复制体系
5’ 3’
拓扑异构酶 解旋酶类 SSB
➢ 同源性高，获得杂合体 几率低
第三节定向进化的筛选技术
➢ 在定向进化中尽管突变体具有随机性，但通过选 择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实 验条件限制突变种类降低突变率缩小突变库的容 量，不仅减少了工作量更重要的是加快了酶在某 一方向的进化速度。
手段: 高通量筛选体系和超高通量筛选体系建立。 （对比以前的挑单菌落摇瓶复筛，筛选数目多， 试剂少，信号灵敏，自动化程度较高）
进化方向符合人类社会需求。
理性设计与非理性设计的对比
➢ 理性设计（定点突变，杂合） 对蛋白结构和功能关系比较清楚，设计一定蛋白结构（如 一级结构的氨基酸序列）来改变蛋白功能
➢ 非理性设计（定向进化） 无需知道蛋白结构和功能关系，直接筛选适合（催化）功 能的蛋白酶，再了解这些高活力酶蛋白对应的结构
➢ 半理性设计(semi-rational design)结合了两种方法的优点， 它在定向进化的基础上加入了理性设计的元素，将随机突 变限制在一个或几个残基上，可以有效的在一个较小的突 变库中获得性质改善的突变体，可以大大提高获得阳性突 变体的几率
DNA聚合酶（I II III）
引物 dNTP Mg2+
Mullis的PCR构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
模板：DNA 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 反应缓冲液 辅助因子：Mg2+
PCR反应体 系
Taq
P2
Mg2+
P1 dATP
dCTP
dTTP dGTP