外周血染色体制备及分析

外周血染色体制备及分析

原理：人体外周血淋巴细胞在植物凝集素(PHA)的刺激下，能转变为具有分裂能力的母细胞。外周血细胞经过含有PHA的培养液培养72小时后，再经过秋水仙素的处理，低渗和固定就可获得大量有丝分裂细胞，用空气干燥法制片，胰酶处理，吉姆萨染料显带，便能制备供显微镜分析的染色体标本。由于整个培养过程操作比较繁琐，许多操作步骤对结果都有非常重要的影响，比如接种的血量，培养基的质量，培养的时间和温度，秋水仙素加入的时间和浓度、低渗的时间，预固定、固定的时间以至制片时的温度和湿度等.本实验室经过长期的实践和总结，对培养的每个步骤都实行严格的标准化操作，取得良好的效果，具体方法如下：

一、试剂准备

1、0.2%的肝素溶液

2、0.0005%秋水酰胺溶液（黑色纸包裹避光置4℃冰箱保存）

3、0.075mol/Ll氯化钾溶液

4、3：1甲醇冰醋酸溶液（固定液，临用前配制）

5、10%Giemsa染色液（将Giemsa原液临用前用PH7.4的磷酸缓冲液即PBS新鲜配制）

二、采血与培养取外周血淋巴细胞培养基(RPMI1640)室温复融，并标记姓名、编号，每例标本接种2瓶，肝素湿润的无菌注射器采取静脉血1-2ml，于每瓶接种0.3-0.5ml。置37℃培养箱内培养72小时。每日早晚定时摇匀培养物1次。收获细胞前2小时，用5号针头加入10ug/ml

秋水仙素2-3滴，（培养基中秋水仙素的最终浓度为0.1ug/ml左右）。摇匀后继续培养 2小时。

三、收获细胞

培养箱中取出培养瓶：将培养的细胞移入10ml刻度离心管中，标记姓名、编号，以1000转/分钟，离心10分钟后弃上清。

1低渗处理：向离心管中加入6-8ml事先预温（37℃）的0.075mol/L Kcl低渗液，用吸管轻轻吹打,使细胞均匀悬浮于低渗液中,放回37℃恒温水浴箱（或培养箱）中，静置15-20min，使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。

2、预固定：向离心管中加入固定液（甲醇：冰乙酸3：1）1ml，轻轻混匀。

3、离心以1000转/分钟，离心10分钟

4、固定：吸去上清液，留下沉淀物。沿离心管壁加入新配固定液6-8ml，混匀，室温放置30分钟。

5、离心以1000转/分钟，离心10分钟

6、重复4、5步骤二遍使细胞经过3次固定，除第一次固定至少需30min外，其余两次固定，每次15或30min均可

7、细胞悬液的制备吸去上清液，加适当固定液，制成浓度适合的细胞悬液备用

8、制片、显带和染色

1）制片：用吸管将细胞悬液轻轻混匀后吸取少量，从10cm高处滴至一端倾斜15°经冰水或20%乙醇浸泡过的无脂玻片上,每篇滴2-3滴,然后在酒精灯火焰上来回通过数次,使其干燥；将制备的染色体标本片置鼓风干燥箱内37℃过夜，取出后自然冷却至室温。

2）显带：染色缸中的45ml生理盐水，加2.5ml浓度为0.25%的胰酶溶液（胰酶最终浓度0.013%）用3%Tris3～5滴调整PH值为6.8－7.0，在37℃预热30分钟，将染色体标本片放入胰蛋白酶溶液中消化（恒温）。先将一张标本片分成三段进行预消化，以确定最佳消化时间，一般在30秒～1分钟。

3）染色：将消化过的染色体标本片立即放入10%Giemsa染色液中染色5-10分钟；自来水轻轻冲洗3～5秒钟，晾干。

4）核型分析：

显微镜下常规计数20个分裂相，分析3个G带核型，（异常者分析5个）。如遇到嵌合休加倍计数和分析