厦门大学-操作讲义-实验八.彗星试验单细胞凝胶电泳(SCGE)
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA1陆彩玲，郭松超，鲁力，陈维平，邝晓聪广西医科大学公共卫生学院，广西南宁（530021）E-mail：lcling78@摘要：目的建立体外染锰细胞模型，探讨锰神经毒性的作用机制。
方法：以原代培养的成熟皮层神经元为靶，据本室前期试验结果确定低中高不同浓度的锰液（分别为0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L），与神经细胞共孵育。
显微镜观察各组神经细胞形态学的变化，用单细胞凝胶电泳试验（SCGE）检测神经细胞的DNA损伤，以彗星细胞尾长及彗星样细胞百分率为评价损伤的指标。
结果：光镜下可见不同浓度锰孵育后神经细胞形态学发生改变，单细胞凝胶电泳试验显示神经细胞DNA出现不同程度的损伤，彗星尾长及彗星样细胞百分率较对照组明显增加（P＜0.01）。
尤以高浓度锰组损伤组严重，显著高于中低浓度组（P＜0.01）。
结论：锰不但能引起体外培养的神经细胞外在的形态学损伤，还可导致神经细胞DNA的损伤。
关键词：锰，单细胞凝胶电泳 (SCGE)，DNA损伤目前，随着生产工艺的改进和预防措施的加强，严重的职业性锰中毒已很少发生，但长期低剂量的锰暴露依然存在，并对接触者的潜在影响仍不可低估。
慢性锰中毒是进行性的、不可逆的病变，并且锰对接触者的危害正由临床型向亚临床型转变，因而更为敏感、特异的效应指标，以早期筛检出亚临床中毒者及高危人群，是今后锰神经毒性研究中重点解决的问题。
DNA损伤是遗传毒理学的一个重要研究领域，长期不可逆转的DNA损伤累积可诱导细胞突变、畸变。
单细胞凝胶电泳(Singl cells gel eletrophoresis,SCGE)又称彗星试验（comet assay），由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞 DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，广泛应用于检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面，具有经济、简捷、灵敏等优点，日益广泛地应用在各种诱变剂的遗传毒性检测上。
单细胞电泳或彗星试验
单细胞电泳或彗星试验单细胞电泳或彗星试验(single cell gelelectrophoresis，SCGE) 参照Singh 等的方法略加改进:①制片:将培养液倒掉，0.25％胰蛋白酶和0.02％ EDTA消化细胞，PBS液洗2遍，将细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2 x 105 ／ml，用砂纸打磨载玻片，用70％的酒精浸泡过夜，晾干，预冷备用。
用PBS液配制的0.5％正常熔点琼脂糖(55±2)℃，溶解后，取200μl加在事先准备好的载玻片上，用细玻棒使胶均匀展开或用盖玻片压平，常温下或4℃固化5min，即第1层胶。
取新鲜制备的细胞悬液，在37℃下按1：3的比例与用PBS液配制0.5％低熔点琼脂糖充分混匀后，加入到第1层胶上，立即加盖盖玻片，4℃固化20 min，即第2层胶。
②裂解(250ml)：取下盖玻片，将凝胶载玻片浸入新配制的裂解液中(2．5mol ／L NaCl，10mmol／LTris-HCl，1％月桂酰肌氨酸钠，100mmo/LNa-EDTA，用前加1％2Triton×100和10％DMSO)，4℃裂解1-1.5h。
③解旋：从裂解液中取出载玻片用蒸馏水洗去多余的盐分，移入水平电泳槽解旋20—30 min(1mmol／L Na-EDTA，300mmol／L NaOH，pH 13)。
④电泳：电压20 V，电流200 mA，低温避光，电泳25 min。
⑤染色和观察：0.4 mol／L Tris(pH 7.5)漂洗中和3次，每次5 min，然后滴加5μg／ml溴化乙锭（PI）30μl ，在暗处染色15分钟。
放置4℃避光保存，保持湿润。
24h内观察，以防荧光淬灭。
⑥观察与计数：选择激发波长4OO nm，光栅波长590nm，视野200倍，黑白胶片同步照相，每个剂量3张片子，每片随机观察30～40个细胞。
测定细胞拖尾距离。
计算出拖尾细胞数，同时求出各组平均尾长及标准差，以t检验测其显著性。
SCGE单细胞凝胶电泳
单细胞凝胶电泳实验方案（实验预备）1，制胶：在adorf管中加入0.018g琼脂糖，加3mlPBS置于大烧杯中隔水加热使得琼脂糖溶解。
加热时间大约为3个小时（注意加热时添加水，同时防止水进入胶中）。
制好的凝胶中应无颗粒。
2，配制PBS（pH=7.4）3，磨片4，配制裂解液（500ml）：称取NaCl :73.15g，Na2EDTA:18.612g，Tris:0.6057g加热溶解后再称取肌氨酸钠:5g 加入上述溶液。
用前加入10%DMSO(二甲亚砜):50ml和1%TritonX-100:10ml的混合液（此混合液先用NaOH调制成pH=10）5，配制电泳缓冲液：NaOH:12g、Na2EDTA:0.372g;、蒸馏水:1000ml。
6，中和液：（pH=7.5）Tris: 24.25g、NaCl:10.8mg 溶于400ml蒸馏水中，定容至50ml。
7，单细胞悬液制备：取肝、肾等目标组织置于青霉素小瓶内除被膜，先用眼科剪刀剪成小块，再用预温的37℃PBS洗两遍，然后用眼科剪刀尽量剪碎脏器。
加适量PBS悬浮细胞，收集细胞悬浮液于1.5ml的dorf管中，静置下沉3min，将上部均匀悬液转至1.5ml的adorf管中，4000r/min，离心30s，其上清，用适当的PBS将细胞浓度调制104-105个/ml。
用台盼蓝排斥法观察细胞存活率，或者剪碎后用1ml无针头针筒吹吸2-3min加PBS后过110目不锈钢筛网过滤收集细胞悬液。
8，EB配制（50mg/L）母液：称取0.03gEB于5ml的adorf管中加入ml蒸馏水配成母液，用前取母液3ul和1000ul蒸馏水稀释。
制法：A，在45℃下将正常溶点的琼脂糖（NMA）的磷酸缓冲液(PBS)浇注到磨粗的载玻片上，置于4℃下10min使得琼脂糖固化。
B，在37℃下，将约1000个悬于10ul的PBS中的受检细胞与75ul0.5%低熔点琼脂糖相混（LMA）。
单细胞电泳
单细胞凝胶电泳法检测单细胞DNA损伤Andy(2010-08-11 11:41:12)摘要单细胞凝胶电泳技术已广泛应用于单细胞DNA 损伤的检测。
其实验原理在于损伤的DNA 在电场中从核内溢出，形成与细胞核“关部”相区别的“尾部”。
目前主要用开头指标、距离指标强度指标、“矩”类指标等四类指标分析实验结果。
关键词单细胞电泳；DNA 损伤；结果分析单细胞凝胶电泳（single-cell gel eiectrophoresis,SCGE）又称慧星试验（comet assay）是一项较新的电泳方法。
自1978年被Rydcbert B。
等人成功地用于检验DNA单链断裂以来，经过不断的改进，已成为一种快速、灵敏、简便的检测DNA损伤的方法，广泛地应用于DNA放射损伤、DNA剪切损伤、DNA交联的检测、药物的遗传毒性评价、细胞凋亡鉴定等工作中[1]。
1 SCGE 的检测原理尽管SCGE 技术己应用近20 年，但其检测单个细胞DNA 损伤的确切原理还不甚清楚。
初步认为，各种因素诱发细胞DNA 损伤后会影响DNA 的高级结构，使其超螺旅松散。
这种细胞经过实验中细胞原位裂解、DNA 解链等过程后，电泳时，损伤的DNA 从核中溢出，朝阳极方向泳动，产生一个尾状带，未损伤的DNA 部分保持球形，二者共同形成“慧星”。
在一定范围内，“慧星”的长度（代表DNA 迁移距离）和经荧光染色后“慧星”荧光强度（代表DNA 的量）与DNA 损伤程度相关，这样就可以定量检测单个细胞中的DNA 损伤[2,3] 。
2 SCGE 的操作方法singh 等人[4] 于1988 年描述的SCGE 具体操作方法，被认为是经典的操作方法。
其主要步骤有：将混有待测细胞的琼脂糖铺于载玻片上，凝固后浸入冷溶解液中使细胞裂解，在电泳液中解链后水平电泳，洗涤后用DNA 结合荧光染料染色，在荧光显微镜下观察玻片上细胞的荧光图像，评价DNA 的损伤程度。
改变相关的实验条件，可以检测DNA 不同类型的损伤，这是SCGE 的优势之一[5] 。
单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用
陕西师范大学硕士学位论文单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用姓名：罗明志申请学位级别：硕士专业：动物学指导教师：齐浩20050501单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用罗明志摘要单细胞凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｓｉｓ，ＳＣＧＥ），又称彗星实验（ｃｏｍｅｔａｓｓａｙ），是一种在单细胞水平进行ＤＮＡ损伤的检测方法，具有简便、灵敏、快捷、样品用量小等优点，广泛用于遗传毒性检测、环境毒性检测、分子流行病学和ＤＮＡ损伤与修复等研究领域。
我们在本实验室建立了单细胞凝胶电泳技术，并对部分操作流程进行了改良，包括（１）制胶方法改良；（２）增加水洗；（３）进行梯度酒精脱水。
在上述改良过程中，我们用“灌胶”法在载玻片上制胶，替代了传统的使用磨砂载玻片上“三明治”制胶，解决了彗星实验中常见的脱胶现象，脱水后有利于获得平整胶面：在裂解后增加了水洗步骤，以消除裂解液中的高盐和去垢剂对后续实验操作的影响；采用直流稳压电源进行单细胞电泳，保证了实验结果的可重复性；对染色的条件进行了筛选，确定了使用ＥＢ作为细胞ＤＮＡ的荧光染料；以ＣＡＳＰ（免费）作为彗星图像的分析软件，建立了图像分析的方法。
这些实验步骤的改良以及实验流程的优化或标准化．简化了操作程序，节省了时间，并使结果分析更加简便。
为了验证上述改良后的实验系统是否可靠，我们用紫外线作为损伤因子处理细胞，诱导细胞ＤＮＡ损伤，然后用彗星实验检测这一损伤。
从这～阳性模型的结果分析来看，发现细胞损伤呈现出很好的时间依赖性，表明该实验系统的可靠性。
我们同时筛选并评价了彗星实验中有关的ＤＮＡ损伤分析指标，发现ＴａｉｌＬｅｎｇｔｈ，ＣｏｍｅｔＬｅｎｇｔｈ，ＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ和ＯｌｉｖｅＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ作为ＤＮＡ损伤的评价指标比较可靠。
我们建立了肝细胞的组织块原代培养系统。
在建立肝细胞组织块原代培养实验流程中，我们对实验的各个步骤，例如组织块贴壁需要的时间、细胞生长所需的培养基种类、培养基添加剂以及动物组织供体年龄等进行了筛选，建立了小鼠肝细胞组织块的原代培养系统。
单细胞凝胶电泳检测技术.
单细胞凝胶电泳检测技术摘要：单细胞凝胶电泳技术又称彗星实验，是一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法，具有快速、简便、价廉的优点。
近年来越来越多的应用于遗传毒理学、生物和环境检测、肿瘤学的研究，本文就这些方面进行了综述。
关键词：单细胞电泳DNA损伤与修复单细胞凝胶电泳（single cell electrophoresis assay, SCGE）又称彗星试验（comet assay）,是一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法，由Ostling等于1984年首次提出，并利用该技术在中性条件下检测γ射线引起的DNA双链断裂。
1988年Singh等建立了碱性单细胞凝胶电泳技术。
1997年，Santos等首次将SCGE技术与DNA荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)结合起来，为SCGE技术的应用开辟了新的途径。
2001年，Nadin等建立了SCGE银染法，进一步提高了损伤DNA分析的灵敏度[1]。
1．SCGE 技术原理及方法1．1 原理在中性条件下，DNA双链不打开，只有DNA双链断裂时，才有DNA断片进入凝胶中迁移；在强碱条件下，DNA双链被打开，释放出断裂的DNA片段，电泳时，带负电荷的DNA移向正极，形成“彗星”状影像，DNA损伤越多，进入尾部的DNA碎片越多。
尾长在辐射高剂量时达到饱和不再增加，而尾矩则与辐射量呈线性相关。
因此，在尾长、密度、面积、尾矩等各项分析指标中，尾矩能更精确地测定DNA损伤。
[2]1．2 实验方法首先制备细胞悬液，并用PBS调整细胞浓度为106~107个/ml，细胞溶解后再进行DNA损伤的诱导处理。
1．2．1 制片有3种类型: (1) “三明治”凝胶,第1层为100~110μl 10.5%的NMA,第2层为合细胞悬液的LMP75μl,第3层仍为LMP75μl。
(2)双层凝胶,即不铺第3层胶; (3)单层凝胶,为改善其易与玻片分离的特点,可在玻片上制一凹槽进行单层灌胶[3]。
单细胞凝胶电泳试剂盒说明书
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）使用说明书一、原理DNA在自由基（如·OH）的攻击下容易发生损伤，即脱氧戊糖遭到破坏，磷酸二脂键的断裂，碱基的破坏或脱落，便可进一步产生单链断裂或双链断裂。
将细胞固定于低熔点琼脂糖中，取少量细胞涂在载玻片上，用碱高盐溶液破坏细胞膜，再用碱溶液使DNA分子解旋。
将载玻片置于电泳液中，在电场的作用下，DNA 分子向阳极移动。
如果DNA损伤严重，碎片多，则电泳速度快。
未受损伤的DNA 大分子则由于细胞膜的阻隔，滞留在原处。
用EB染色，可观察到DNA受损的细胞形同彗星现象，作定性分析。
也可用相关的软件作定量分析。
二、试剂盒组成三、操作步骤1．细胞用冰冷的PBS洗一次，离心收集，用PBS重悬使其密度为1×106个/ml。
2．铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS配制，第1层凝胶的制备：加热熔解的正常熔点琼脂糖，冷至45-60℃，取100μL铺于载玻片上，盖上干净的盖玻片，置4℃下10min使琼脂糖凝固。
第2层凝胶的制备：将10μL细胞（约 104个）和75μL的0.7%低溶点琼脂糖（在37℃水浴加热30min使之完全溶化）混合均匀。
然后，迅速将含细胞的低溶点琼脂糖滴到第1层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置4℃下10min使第2层琼脂糖凝固。
3．细胞裂解：移去盖玻片，将载玻片置于平皿中,倒入预冷的裂解液（使用前每9 ml加入1 ml的DMSO），4℃裂解1～2h，取出载玻片用PBS漂洗。
要求动作轻柔，以免琼脂糖脱落。
4．DNA解旋：将载玻片再次置于平皿中，倒入解旋液，室温放置20～60min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA断链在电场中易于迁移。
5．电泳：将载玻片置于水平电泳槽。
倒入电泳液，约覆过载玻片胶面0.25cm左右。
调节电压15-25V，电泳20～30min。
建议预实验，摸索最佳的电压、电流及时间。
6．中和与染色：电泳后将载玻片置于平皿内。
彗星电泳
每片滴加60ulPI( 5ug/ml) 染色20min.用蒸馏水 洗一下即可观察。
取出玻片放于无Ca2+、Mg2+的PBS中洗1-2次，吸
水纸吸干； 每片载玻片上加60μl 2μg/ml PI染色15min， 蒸馏水冲洗盖玻片观察并拍照（Olympus荧光显 微镜绿色激发光下观察）；
用casp. exe软件分析细胞拖尾变化
思考题
彗星实验的原理？ 彗星实验的评价方法？
步骤
γ射线照射细胞后，分别于照射后0h，30’， 1h，2h，4h收集细胞并做细胞计数，以 适量PBS重悬细胞；
胶片制备
取100 ul 用微波炉熔解的 1%正常熔点琼脂糖(NMA)滴 在预热的(45℃~70℃)磨砂载玻片上，迅速盖上干净的 盖玻片，4℃ 15分钟，(第一层) 将琼脂糖凝固后，取下盖玻片。将细胞悬液（约3000 个cell/片）与180ul0.65%低熔点琼脂糖溶液在37℃混 匀后，取一半液体滴在第一层的琼脂糖上（2个/载）， 盖上盖玻片，4℃，15min.( 第二层越薄越好，使细胞 尽量在一个平面上) 取下盖玻片，在第二层上滴加60ul0.65%低熔点琼脂糖， 4℃，15min。（第三层）
彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤
目的
掌握彗星电泳的原理 熟悉彗星电泳的操作方法 掌握彗星电泳的评价方法
原理
单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis， SCGE)是由Ryberg B和Jonhanson K J首先提出后又经 Singh N P和Olive P I进一步完善的一种在单细胞水 平上检测DNA损伤与修复的方法。因其细胞电泳形状 颇似彗星，又称彗星试验(comet assay)。它是一种 测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术，与传 统方法相比，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需 放射性标记，具有极高的实用价值。目前该技术已广 泛地应用于体内、体外各种有核细胞经受试物诱导的 DNA损伤和修复的研究 。
彗星实验
Comet Assay 彗星分析系统软件功能:彗星试验-单细胞凝胶电泳Single cell gel electrophoresis是一种快捷、高灵敏度的检测DNA受损的方法.Comet Assay 专业彗星试验图像分析软件,提供专业快速的测量方法。
测量指标包括头半径，尾长度，积分光密度，头/尾DNA含量比例，尾矩，Olive 矩等多种参数。
具有自动或手动调节分割彗星头部和尾部功能同时提供对双染色系统的分析系统可广泛用于环境毒理学中对DNA具有损伤作用的分析：如紫外光、电离辐射、氧自由基等因素造成的DNA损伤。
以及细胞凋亡，抗癌药物的药物毒理学研究，遗传毒理研究和肿瘤治疗的跟踪监测等单细胞凝胶电泳(彗星试验):原理、应用和局限性彗星试验：原理、应用和局限性1. 前言过去十年中，彗星试验或单细胞凝胶电泳（SCGE）已成为一个评定DNA损伤的标准方法，广泛应用于遗传毒性试验、人类生物监测和分子流行病学、生态毒理学以及DNA损伤修复的基础研究，且因其简单、灵敏、多功能、快速、经济实用而赢得了广大科研工作者的青睐，和其有关的文献数目逐年上升。
在应用彗星试验时不会过多去考虑它如何运作和它提供何种信息，因为它在论证DNA损伤中的成功已足以证明它的价值。
这一点实在太可惜，因为它不仅能告诉我们细胞内存在的损伤的类型，而且能告诉我们损伤的程度。
尽管彗星试验是检测DN A断裂的基本方法，但由于对特异性核酸内切酶损伤的引入使其可以检测紫外线诱导的嘧啶二聚体，氧化碱基和烷基化损伤。
2.检测原理和检测指标2.1 背景二十世纪七十年代，Peter Cook和其同事们制定了一种用非离子去污剂使细胞溶解来研究核结构的方法。
这种处理除去胞膜、胞质和核质，并使核小体破裂（几乎所有的组蛋白均被浓盐提取），剩下的就是由核基质或RNA、蛋白质组成的支架以及DNA所构成的类核，其DNA的双螺旋以核小体的组蛋白为核心形成负超螺旋结构。
超螺旋的存在使DNA不能自由旋转，Cook 等提出一个模型，DNA间断的附加于基质，有效的形成一系列环状、而不是线性分子。
彗星分析实验：单细胞凝胶电泳
实验步骤
6. 中和、染色
– 将载玻片置于大平皿中，用中和液中和2～3次， 4℃，每次 15min
– 用滤纸将缓冲液吸干 – 每凝胶滴加100 μl AO, 染色20min （避光） ； – 将玻片在蒸馏水中漂洗（避光）。
实验步骤
7. 观察、拍照和分析：
– 置荧光显微镜下，拍照 – 用专用的软件进行分析。
彗星的测量
• 尾长，彗星头部中心到尾部最远端的距离。
– 尾长只在相对低的损伤水平增加，随后损伤剂 量增加时，尾部光密度增加，而尾长不变
彗星的测量
• 头尾光密度比，通常以尾部DNA量占全部 DNA量的百分比表示。
– 与损伤频率成线性关系，受阈值设定的影响较 小，并在最大范围内分辨损伤（理论上，尾部 DNA从0%-100%）
基本原理
• 若细胞受损，在碱性电泳液（pH>13）中， DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断 裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时 断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成 拖尾。
基本原理
• 细胞核DNA 受损伤越严重，产生的断链就越多， 片段也越小，电泳表现为尾长增加和尾部荧光 增强。
• 因此，通过测定DNA 迁移部分的光密度或迁移 长度就可定量测定单个细胞损伤的程度。
玻片上使胶均匀展开，室温固化10min
实验步骤
2. 制片：第2 层凝胶的制备 • 将细胞与0.7%LMA 混合均匀（体积比1/9） • 迅速将适量（100～200μl）含细胞的LMA
滴到第1 层琼脂糖上，室温固化10min
实验步骤
3. 细胞裂解： • 将玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜
配置的细胞裂解液。4℃下避光裂解2-3h； • 取出载玻片用PBS漂洗2次（要求动作轻柔，
单细胞凝胶电泳(SCGE)技术
单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）技术单细胞凝胶电泳（SCGE），因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验（Comet Assay）。
它用于检测单个哺乳动物细胞DNA的损伤，与传统方法相比，因其快捷，灵敏，样品消耗少，费用较低，时至今日已广泛应用于各种有核细胞经受试因子作用后诱导出现的DNA损伤和修复的实验，成为遗传毒理学、氧化损伤、DNA交联损伤、放射生物学等领域中一项重要的研究工具。
【1，2】近年来，国内关于这一方法的应用的报道日益增多【3～5】，可以预见，SCGE技术随着其方法的逐渐标准化，定将在今后得到更加广泛的应用。
因此，本文拟就有关SCGE方法的产生、操作程序、影响因素等作一综述。
1.SCGE的诞生（DNA损伤检测方法的研究）DNA损伤与修复是遗传毒理学及分子流行病学研究的一个重要目标，很久以前人们就在寻求一种合适的检测这一效应的方法。
从使用DNA材料上分可将各种方法归为两类：（1）以裸DNA为材料检测，即通过去污剂、蛋白水解等方法去除附着于DNA上的其他细胞组分，分离出DNA；（2）以拟核为材料，即DNA构型（环区）保留于核骨架上，超螺旋结构不变。
SCGE技术属于第二种方法，显然，拟核成分的检测较裸DNA要方便得多【6】。
在此基础之上，早期的同位素示踪法因需提供同位素标记的样品，并预先确定合适的标记部位。
为解决此不便，目前多采用直接检出DNA损伤后直接生成的单链断裂【7】。
最初，Lett等应用碱性蔗糖梯度离心法测定DNA单链分子量，用于研究哺乳动物细胞的DNA损伤【8】。
不久Kohn等又将其改进为更为灵敏的碱性洗脱法，成为一种较稳定的检测方法【9】。
但是这些技术的灵敏度仍不能满足现在研究的要求，干扰因素多，同时要有放射性同位素示踪。
1984年由Ostling和Johanson首先介绍的SCGE技术在这些方面得到了显著改善，特别在1988年经Singh等完善的单细胞碱性微板电泳技术后，本方法已成为检测单个细胞DNA单链断裂的首选方法【2】。
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC 波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价D N A损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％ RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP 软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。
单细胞凝胶电泳试验操作步骤
一、实验准备工作，要在实验前一天完成。
1.镀膜：将载片竖直放入盛有1%常熔点琼脂糖的立式染缸中，静置1 min后缓慢取出，并置于立式染缸中，在37 ℃烘箱中烤膜12 h（防尘）。
2.配制细胞裂解储备液：分别按称量146.25 g氯化钠，37.224g乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA），1.2114 g三羟甲基氨基甲烷，肌氨酸钠（10.124 g），上述质量的四种药品于烧杯中依次溶解，溶解时由于肌氨酸钠容易起泡，故最后加入，由于Na2EDTA难溶可适当加热进行溶解，同时可用磁力搅拌器进行搅拌，溶解后用容量瓶定容至1000 mL，将配好的溶液放入冰箱4 ℃保存。
）3.配置磷酸缓冲液（PBS、pH=6.8）：KH2PO44.5 g、Na2HPO4·12H2O 11.81 g、H2O 1000 mL，混合后置4 ℃备用。
二、实验工作，要细心操作。
1.构槽：用市售的透明胶带（两层）在镀上正常熔点琼脂糖膜的载玻片中央构建一个长方形小槽，或者在一张载玻片上搭两个槽。
构建好后放回载玻片架并用一次性手套套住（防尘）。
2.取细胞裂解储备液、二甲亚砜、TritonX-100按体积比89：10：1量于锥形瓶中混匀（TritonX-100粘性大，用枪头吸取时手要慢慢放开，将液体打入锥形瓶中，然后要反复吹打，尽量把枪头壁上的液体打入锥形瓶中），然后用NaOH调pH=10！！！4 ℃静置,放入冰箱，进行温度平衡。
3.电泳缓冲液：称取0.3722 gNa2EDTA，12.0000 gNaOH定容至1L，pH=13，室温保存。
4.将水浴锅打开，把温度调到65 ℃。
5.骨髓细胞悬液制备：分离股骨，PBS液清洗，打开骨髓腔，取4 ℃PBS液4 mL反复冲洗骨髓，吸取1.5~2 mL所得混合液，4 ℃、3000 r/min离心1 min弃上清；加4 ℃PBS 液1 mL，轻柔混匀，1500 r/min离心5 min弃上清；加入4 ℃PBS液500 µL轻柔混匀，置4 ℃待用，若离心后发现骨髓细胞较少可以适当延长3000 r/min离心时间。
单细胞凝胶电泳试验
单细胞凝胶电泳试验（一）原理单细胞凝胶电泳试验（singlecell gel electro phores is，SCGE）是近年来经过不断完善逐步发展起来的一种快速检测单细胞水平DNA损伤的新技术。
有核细胞的DN A分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，SCGE 分析技术是先用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液的作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内的RN A、蛋白质及其它成分外泄到凝胶中，随后扩散到细胞裂解液中，但核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。
如果细胞未受损伤，电泳时，核DNA因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。
若细胞受损，在中性电泳液（pH=8.0）中，核DNA仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响DN A双螺旋大分子的连续性。
只有当DNA双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。
如果在碱性电泳液（pH>13）中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核DN A向阳性迁移，形成拖尾。
细胞DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量也就越多，迁移的距离越长，表现为尾长的增加和尾部荧光强度的增强。
因此，通过测定DNA 迁移部分的光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞的DNA损伤程度。
（二）仪器1．全磨砂载玻片2．1号盖玻片3．微量吸管和吸头4．冰盒5．电泳仪6．荧光显微镜（三）试剂1．正常熔点及低熔点琼脂糖。
2．细胞裂解液：2.5mol/L NaCl，100mmol/L Na2EDTA，10mmol/L Tris-HCl，1％肌氨酸钠，用NaOH调p H值到10。
单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的方法及应用
六、未来展望
预计在未来，DNA凝胶电泳分析系统将会与更多前沿的生物技术相结合，如纳 米技术、微流体技术等，实现更高效的分离和检测。同时，随着精准医疗和基 因组学的发展，凝胶电泳将在疾病诊断和治疗、个性化医疗等方面发挥重要作 用。此外，随着环境科学和生态学的发展，凝胶电泳也将被广泛应用于环境 DNA样品的分析和研究。
五、结论
单细胞凝胶电泳技术是一种灵敏且实用的工具，可用于检测单个细胞的DNA损 伤。它已经广泛应用于环境科学、放射医学和遗传学等领域，为研究DNA损伤 和修复提供了重要的手段。尽管存在一些挑战和问题，但随着技术的不断发展 和完善，相信单细胞凝胶电泳技术在未来的研究中将发挥更大的作用。
参考内容二
方法
单细胞凝胶电泳的主要步骤包括收集单个细胞、细胞裂解、凝胶电泳和染色。 该技术的原理是基于DNA在凝胶中的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关。 当DNA分子受到损伤时，其迁移速率会受到影响，从而可以通过电泳图像进行 观察和定量分析。
1、收集单个细胞：采用显微操作、流式细胞术或其他细胞分离技术收集单个 细胞。
单细胞凝胶电泳检测DNA损 伤的方法及应用
单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）是一种用于 检测单个细胞内DNA损伤的方法。该技术通过将单个细胞裂解后在凝胶上进行 电泳，可以检测到DNA的片段化程度和总DNA量的变化，从而评估细胞内DNA的 损伤程度。本次演示将介绍单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的方法及其在各个领 域的应用，并通过具体案例进行分析和说明。
2、实验过程：收集单个白细胞或睾丸细胞，裂解后将DNA样本在凝胶上进行电 泳。通过观察电泳图像，发现经过辐射处理的样品中出现了明显的DNA片段化 现象，而对照样品则没有。同时，通过定量分析软件对电泳图像进行半定量分 析，比较不同样本中DNA片段化和总DNA量的变化情况。
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
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用浓度为2μg/ml的PI染色液4℃染色5min。染色结束，用 预冷的PBS漂洗2min，弃PBS，50%甘油保湿。3h内阅完 玻片。
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操作步骤
(10)镜检
使用荧光正置显微镜观察玻片，仪器参数设置为490nm激 发光(蓝绿色，看见红色荧光)、200倍观察、TIFF格式保存 文件。阅片时要保持玻片湿润，先低倍大体观察，再选择 有代表性区域阅片。
应用：是检测DNA微损伤的新方法， 在国际遗传毒性检测程序工作会议上已得到认可。 检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、 监测环境污染物对机体的遗传损害、 研究毒物致癌机制，等
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单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
特点： ①实验流程短(一天可完成实验); 图像获取和数据分析可隔日 完成； ②在单细胞水平上对DNA损伤进行可视性检测； ③准确性好、灵敏度高。
铺好的玻片完全浸入临用配制的预冷细胞裂解液中，4℃ 水 平放置，裂解2 h。
(5) 解链
将载玻片小心浸入预冷的解链电泳液中，4℃水平放置， 解 链0.5h。
(6) 电泳
接通电源，在300mA和25V条件下电泳20min。(调节液面)
12
操作步骤
(7) 中和
电泳结束，将载玻片小心转移到托盘，浸入中和液中和 20min。中和后用冰水洗2次，2min/次。
(11)单细胞凝胶电泳结果分析
每片随机观察100个细胞，计数彗星细胞百分率，用目镜 测 微尺测量彗星细胞尾矩，进行统计学分析。 统计学分析：采用SPSS软件进行单因素方差分析，各组 间 两两比较采用q检验。
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实验记录
表1 不同剂量镉处理LO2细胞中彗星细胞百分率和尾长比较
组别
细胞数 彗星细胞尾长 范围(μm)
细胞吹散成单个细胞悬液，计数。 2,000rpm，4℃，离心5分钟收集细胞，按1×106个/ml的密度 加入4℃预冷的PBS溶液重悬，充分混匀细胞后置于冰上(最 后调整细胞浓度，与胶混合铺片后保证细胞是105个/ml即可)。
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操作步骤
(2) 铺底层琼脂糖凝胶(操作)
光面载玻片和盖玻片，按顺序标记
配制0.65%正常熔点琼脂糖，微波炉中加热1min， 摇匀，重复2~3次使其完全融解
75℃水浴锅保温
将干燥的载玻片缓慢浸入正常熔点凝胶中反复5~6次使得 凝 胶均匀分布在载玻片上，擦去载玻片背面残留的琼脂糖 ， 37℃温箱干燥(一次性铺好一天要用的底层琼脂糖凝胶 )
10
操作步骤
(3)铺低熔点琼脂糖凝胶
更 快，电泳后出现彗星状，即可判断DNA损伤。 根据彗星的尾长、尾密度、尾矩进行DNA链断裂的半定
量分析
+极
—极
2
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
评价： 细胞未受损伤：电泳中细胞核DNA(分子量大)而停留在核
基 质中；荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象 DNA链断裂损伤：细胞受损，DNA链断裂的碎片(分子量小)
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实验目的
掌握SCGE试验的原理 熟悉SCGE试验的操作和应用 了解SC8)条件下，核DNA 仍保持双螺旋结构，虽偶有 单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有 当 DNA双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向 阳极迁 移，形成荧光拖尾现象，形似彗星
准备0.8%的低熔点琼脂糖凝胶，放置在37℃水浴锅里待用
吸取30μl的细胞悬液和270μl的低熔点凝胶充分混匀 在铺有0.65%的底层正常熔点凝胶的玻片上铺90μl顶层低 熔点凝胶细胞混合液(9000 cells) 盖上盖玻片，过程中避免气泡产生
冰上放置20min后小心移去盖玻片
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操作步骤
(4) 细胞裂解
彗星细胞百分率 (%)
Cd 0μM
Cd 10μM
Cd 20μM
Cd 40μM
统计学分析： SPSS软件，单因素方差分析，各组间两两比较采用q检验。
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测微尺介绍
目镜测微尺：为一块圆形玻片，上面有刻度； 镜台测微尺：一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆
圈 内刻有分度，将长1mm的直线等分为100小格，每小格 等于 0.01mm。
，电泳时在凝胶中离开核基质向阳极迁移；电泳后出现彗 星 状拖尾 损伤细胞比例分析：计数定量(100个)细胞，其中有彗星拖 尾 的细胞比例(%) 半定量分析：根据彗星的尾长、尾密度(荧光强度)、尾矩进 行 单个细胞DNA链断裂程度的评价
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单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
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测微尺介绍
测量步骤： 1、放置目镜测微尺 2、放置镜台测微尺 3、校正目镜测微尺 4、卸下镜台测微尺 5、放上待测样本片，进行测量(细胞核大小和尾长等)
在强碱(pH>13)条件下，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链 ，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或 碎 片离开核DNA向阳性迁移，形成拖尾
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实验原理
细胞DNA受损愈重
产生断链或碱易变性断片愈多 /
其断链或断片也就愈小
电场作用下迁移DNA量多距
离长 尾长增加&尾部荧光强度增强
因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定 量 地测定单个细胞DNA损伤的程度。
尾长在高剂量时达到饱和不再增加，而尾矩则与剂量呈 线 性相关。因此，在尾长、密度、面积、尾矩等各项分
析指 标中，尾矩能更精确地测定DNA损伤。
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操作步骤
(1) 细胞处理(已做)
取处于对数生长期的各细胞消化后按照3×105/孔接种于六孔 板，按如下分组进行处理： 对照组： 用等量的NS处理； 镉(CdCl2)暴露组：镉处理剂量为10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)；处理时间为24 h，终止处理后收获细胞。
分子与细胞毒理学实验
——单细胞凝胶电泳(SCGE) (彗星试验, Comet Assay)
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
又称彗星试验(comet assay) 是一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法； 原理：DNA损伤时，断裂的DNA片段比大片段DNA迁移的