厦门大学-操作讲义-实验八.彗星试验单细胞凝胶电泳(SCGE)
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(8) PI染色
用浓度为2μg/ml的PI染色液4℃染色5min。染色结束，用 预冷的PBS漂洗2min，弃PBS，50%甘油保湿。3h内阅完 玻片。
13
操作步骤
(10)镜检
使用荧光正置显微镜观察玻片，仪器参数设置为490nm激 发光(蓝绿色，看见红色荧光)、200倍观察、TIFF格式保存 文件。阅片时要保持玻片湿润，先低倍大体观察，再选择 有代表性区域阅片。
应用：是检测DNA微损伤的新方法， 在国际遗传毒性检测程序工作会议上已得到认可。 检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、 监测环境污染物对机体的遗传损害、 研究毒物致癌机制，等
4
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
特点： ①实验流程短(一天可完成实验); 图像获取和数据分析可隔日 完成； ②在单细胞水平上对DNA损伤进行可视性检测； ③准确性好、灵敏度高。
铺好的玻片完全浸入临用配制的预冷细胞裂解液中，4℃ 水 平放置，裂解2 h。
(5) 解链
将载玻片小心浸入预冷的解链电泳液中，4℃水平放置， 解 链0.5h。
(6) 电泳
接通电源，在300mA和25V条件下电泳20min。(调节液面)
12
操作步骤
(7) 中和
电泳结束，将载玻片小心转移到托盘，浸入中和液中和 20min。中和后用冰水洗2次，2min/次。
(11)单细胞凝胶电泳结果分析
每片随机观察100个细胞，计数彗星细胞百分率，用目镜 测 微尺测量彗星细胞尾矩，进行统计学分析。 统计学分析：采用SPSS软件进行单因素方差分析，各组 间 两两比较采用q检验。
14
实验记录
表1 不同剂量镉处理LO2细胞中彗星细胞百分率和尾长比较
组别
细胞数 彗星细胞尾长 范围(μm)
细胞吹散成单个细胞悬液，计数。 2,000rpm，4℃，离心5分钟收集细胞，按1×106个/ml的密度 加入4℃预冷的PBS溶液重悬，充分混匀细胞后置于冰上(最 后调整细胞浓度，与胶混合铺片后保证细胞是105个/ml即可)。
9
操作步骤
(2) 铺底层琼脂糖凝胶(操作)
光面载玻片和盖玻片，按顺序标记
配制0.65%正常熔点琼脂糖，微波炉中加热1min， 摇匀，重复2~3次使其完全融解
75℃水浴锅保温
将干燥的载玻片缓慢浸入正常熔点凝胶中反复5~6次使得 凝 胶均匀分布在载玻片上，擦去载玻片背面残留的琼脂糖 ， 37℃温箱干燥(一次性铺好一天要用的底层琼脂糖凝胶 )
10
操作步骤
(3)铺低熔点琼脂糖凝胶
更 快，电泳后出现彗星状，即可判断DNA损伤。 根据彗星的尾长、尾密度、尾矩进行DNA链断裂的半定
量分析
+极
—极
2
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
评价： 细胞未受损伤：电泳中细胞核DNA(分子量大)而停留在核
基 质中；荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象 DNA链断裂损伤：细胞受损，DNA链断裂的碎片(分子量小)
5
实验目的
掌握SCGE试验的原理 熟悉SCGE试验的操作和应用 了解SC8)条件下，核DNA 仍保持双螺旋结构，虽偶有 单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有 当 DNA双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向 阳极迁 移，形成荧光拖尾现象，形似彗星
准备0.8%的低熔点琼脂糖凝胶，放置在37℃水浴锅里待用
吸取30μl的细胞悬液和270μl的低熔点凝胶充分混匀 在铺有0.65%的底层正常熔点凝胶的玻片上铺90μl顶层低 熔点凝胶细胞混合液(9000 cells) 盖上盖玻片，过程中避免气泡产生
冰上放置20min后小心移去盖玻片
11
操作步骤
(4) 细胞裂解
彗星细胞百分率 (%)
Cd 0μM
Cd 10μM
Cd 20μM
Cd 40μM
统计学分析： SPSS软件，单因素方差分析，各组间两两比较采用q检验。
15
测微尺介绍
目镜测微尺：为一块圆形玻片，上面有刻度； 镜台测微尺：一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆
圈 内刻有分度，将长1mm的直线等分为100小格，每小格 等于 0.01mm。
，电泳时在凝胶中离开核基质向阳极迁移；电泳后出现彗 星 状拖尾 损伤细胞比例分析：计数定量(100个)细胞，其中有彗星拖 尾 的细胞比例(%) 半定量分析：根据彗星的尾长、尾密度(荧光强度)、尾矩进 行 单个细胞DNA链断裂程度的评价
3
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
16
测微尺介绍
测量步骤： 1、放置目镜测微尺 2、放置镜台测微尺 3、校正目镜测微尺 4、卸下镜台测微尺 5、放上待测样本片，进行测量(细胞核大小和尾长等)
在强碱(pH>13)条件下，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链 ，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或 碎 片离开核DNA向阳性迁移，形成拖尾
7
实验原理
细胞DNA受损愈重
产生断链或碱易变性断片愈多 /
其断链或断片也就愈小
电场作用下迁移DNA量多距
离长 尾长增加&尾部荧光强度增强
因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定 量 地测定单个细胞DNA损伤的程度。
尾长在高剂量时达到饱和不再增加，而尾矩则与剂量呈 线 性相关。因此，在尾长、密度、面积、尾矩等各项分
析指 标中，尾矩能更精确地测定DNA损伤。
8
操作步骤
(1) 细胞处理(已做)
取处于对数生长期的各细胞消化后按照3×105/孔接种于六孔 板，按如下分组进行处理： 对照组： 用等量的NS处理； 镉(CdCl2)暴露组：镉处理剂量为10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)；处理时间为24 h，终止处理后收获细胞。
分子与细胞毒理学实验
——单细胞凝胶电泳(SCGE) (彗星试验, Comet Assay)
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
又称彗星试验(comet assay) 是一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法； 原理：DNA损伤时，断裂的DNA片段比大片段DNA迁移的
用浓度为2μg/ml的PI染色液4℃染色5min。染色结束，用 预冷的PBS漂洗2min，弃PBS，50%甘油保湿。3h内阅完 玻片。
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操作步骤
(10)镜检
使用荧光正置显微镜观察玻片，仪器参数设置为490nm激 发光(蓝绿色，看见红色荧光)、200倍观察、TIFF格式保存 文件。阅片时要保持玻片湿润，先低倍大体观察，再选择 有代表性区域阅片。
应用：是检测DNA微损伤的新方法， 在国际遗传毒性检测程序工作会议上已得到认可。 检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、 监测环境污染物对机体的遗传损害、 研究毒物致癌机制，等
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单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
特点： ①实验流程短(一天可完成实验); 图像获取和数据分析可隔日 完成； ②在单细胞水平上对DNA损伤进行可视性检测； ③准确性好、灵敏度高。
铺好的玻片完全浸入临用配制的预冷细胞裂解液中，4℃ 水 平放置，裂解2 h。
(5) 解链
将载玻片小心浸入预冷的解链电泳液中，4℃水平放置， 解 链0.5h。
(6) 电泳
接通电源，在300mA和25V条件下电泳20min。(调节液面)
12
操作步骤
(7) 中和
电泳结束，将载玻片小心转移到托盘，浸入中和液中和 20min。中和后用冰水洗2次，2min/次。
(11)单细胞凝胶电泳结果分析
每片随机观察100个细胞，计数彗星细胞百分率，用目镜 测 微尺测量彗星细胞尾矩，进行统计学分析。 统计学分析：采用SPSS软件进行单因素方差分析，各组 间 两两比较采用q检验。
14
实验记录
表1 不同剂量镉处理LO2细胞中彗星细胞百分率和尾长比较
组别
细胞数 彗星细胞尾长 范围(μm)
细胞吹散成单个细胞悬液，计数。 2,000rpm，4℃，离心5分钟收集细胞，按1×106个/ml的密度 加入4℃预冷的PBS溶液重悬，充分混匀细胞后置于冰上(最 后调整细胞浓度，与胶混合铺片后保证细胞是105个/ml即可)。
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操作步骤
(2) 铺底层琼脂糖凝胶(操作)
光面载玻片和盖玻片，按顺序标记
配制0.65%正常熔点琼脂糖，微波炉中加热1min， 摇匀，重复2~3次使其完全融解
75℃水浴锅保温
将干燥的载玻片缓慢浸入正常熔点凝胶中反复5~6次使得 凝 胶均匀分布在载玻片上，擦去载玻片背面残留的琼脂糖 ， 37℃温箱干燥(一次性铺好一天要用的底层琼脂糖凝胶 )
10
操作步骤
(3)铺低熔点琼脂糖凝胶
更 快，电泳后出现彗星状，即可判断DNA损伤。 根据彗星的尾长、尾密度、尾矩进行DNA链断裂的半定
量分析
+极
—极
2
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
评价： 细胞未受损伤：电泳中细胞核DNA(分子量大)而停留在核
基 质中；荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象 DNA链断裂损伤：细胞受损，DNA链断裂的碎片(分子量小)
5
实验目的
掌握SCGE试验的原理 熟悉SCGE试验的操作和应用 了解SC8)条件下，核DNA 仍保持双螺旋结构，虽偶有 单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有 当 DNA双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向 阳极迁 移，形成荧光拖尾现象，形似彗星
准备0.8%的低熔点琼脂糖凝胶，放置在37℃水浴锅里待用
吸取30μl的细胞悬液和270μl的低熔点凝胶充分混匀 在铺有0.65%的底层正常熔点凝胶的玻片上铺90μl顶层低 熔点凝胶细胞混合液(9000 cells) 盖上盖玻片，过程中避免气泡产生
冰上放置20min后小心移去盖玻片
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操作步骤
(4) 细胞裂解
彗星细胞百分率 (%)
Cd 0μM
Cd 10μM
Cd 20μM
Cd 40μM
统计学分析： SPSS软件，单因素方差分析，各组间两两比较采用q检验。
15
测微尺介绍
目镜测微尺：为一块圆形玻片，上面有刻度； 镜台测微尺：一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆
圈 内刻有分度，将长1mm的直线等分为100小格，每小格 等于 0.01mm。
，电泳时在凝胶中离开核基质向阳极迁移；电泳后出现彗 星 状拖尾 损伤细胞比例分析：计数定量(100个)细胞，其中有彗星拖 尾 的细胞比例(%) 半定量分析：根据彗星的尾长、尾密度(荧光强度)、尾矩进 行 单个细胞DNA链断裂程度的评价
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单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
16
测微尺介绍
测量步骤： 1、放置目镜测微尺 2、放置镜台测微尺 3、校正目镜测微尺 4、卸下镜台测微尺 5、放上待测样本片，进行测量(细胞核大小和尾长等)
在强碱(pH>13)条件下，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链 ，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或 碎 片离开核DNA向阳性迁移，形成拖尾
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实验原理
细胞DNA受损愈重
产生断链或碱易变性断片愈多 /
其断链或断片也就愈小
电场作用下迁移DNA量多距
离长 尾长增加&尾部荧光强度增强
因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定 量 地测定单个细胞DNA损伤的程度。
尾长在高剂量时达到饱和不再增加，而尾矩则与剂量呈 线 性相关。因此，在尾长、密度、面积、尾矩等各项分
析指 标中，尾矩能更精确地测定DNA损伤。
8
操作步骤
(1) 细胞处理(已做)
取处于对数生长期的各细胞消化后按照3×105/孔接种于六孔 板，按如下分组进行处理： 对照组： 用等量的NS处理； 镉(CdCl2)暴露组：镉处理剂量为10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)；处理时间为24 h，终止处理后收获细胞。
分子与细胞毒理学实验
——单细胞凝胶电泳(SCGE) (彗星试验, Comet Assay)
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
又称彗星试验(comet assay) 是一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法； 原理：DNA损伤时，断裂的DNA片段比大片段DNA迁移的