抗生素产生菌初步培养和获取

抗生素产生菌获得和初筛

一：实验目的

学习从土壤中分离微生物的方法

学习采集样品和制备培养基

学习无菌操作技术

二：实验原理

自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多。

土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数同时也可以从其他微生物富集地方（医院附近，废水等）采集样品。

抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。本实验采用的抗生素为β-内酰胺类——青霉素类和）四环素类——土霉素。青霉素属于青霉素类抗生素，干扰细菌细胞壁的合成而产生抗菌作用；土霉素属于四环素类抗生素，作用于病原微生体核糖体30S亚基，抑制肽链的增长，影响细菌或微生物的蛋白质合成。

重铬酸钾可作为比较理想的放线菌分离抑制剂。根据目标菌落出现数量和抑制剂的价格成本, 重铬酸钾是一种理想的放线菌分离抑制剂, 它具有3 个显著特点: ①可抑制土壤中细菌和真菌的生长; ②不影响放线菌的正常生长, 有时还可刺激一些放线菌的生长;③价格低廉, 在进行土壤放线菌大量分离工作中可推广使用。

高氏一号培养基适合放线菌生长。

三：实验材料

四：实验内容

1.培养基配制

高氏一号改良培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 •3H2O 0.5g，MgSO4•7H2O 0.5g，FeSO4•7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，终浓度为50×10-5重铬酸钾，pH7.2～7.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。冷却后，倒制平板数个。

初筛培养基：改良高氏一号培养基（在原来配置的高氏一号琼脂培养基灭菌后，再分别加入青霉素终浓度为10-5，10-4，10-3的药剂），倒制平板数个

2.样品采集

分别从土壤中（将表层5cm左右的浮土除去，取5～25处的土样10～25，装入事先准备好的塑料袋内扎好，给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡），废水（分别取流动处和静止处，并记录相关数据）

3 制备稀释液：

（1）. 称取土壤1g（或量取1nl水样），放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10－2的土壤悬液。

（2）. 另取装有无菌试管5支，用记号笔编上10－3、10－4、10－5、10－6 、10－7 。在每只试管中用无菌吸管加入4.5ml无菌水。

（3）.取已稀释成10－2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取0.5mL 土壤悬液加入10－3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4→10 -5→10-6土壤稀释液。

在土壤稀释过程中，应用一支吸管由浓到稀，稀释到底，稀释方法见图（1）4：平板涂抹：取无菌培养皿，将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的试管中吸取0.1ml对号放入平板上，用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。（图2）

5：培养：将接种后的培养基静置10min后，倒置于28～30℃条件下培养3～4d，计数菌落，并计算出每g土壤中放线菌的数量。（每毫升样品中微生物细胞数=每皿菌落平均数*稀释倍数*1/取样体积数）

6：初筛：选取菌落生长良好，排布均匀的培养基，用接种环分别均匀（3至5处）挑取培养基中的菌落，在无菌条件下分别接种于初筛培养基中，倒置于28～30℃条件下培养3～4d。

抗生素产生菌复筛

一：实验目的

1.掌握紫外光谱定性检测青霉素的方法

2.了解青霉素的抗菌谱

二实验原理

青霉素是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，青霉素在氢氧化钠介质中水解为具有还原性的青霉素噻唑酸后，在沸水加热的条件下，于0.24mol/L硫酸介质中，利用磷钼酸被还原为钼兰的水相显色反应，在720nm处测定其吸光值。

青霉素为β内酰胺抗生素对革兰阳性菌及某些革兰阴性菌有较强的抗菌作用，金黄色葡萄球菌(金葡菌)、肺炎球菌、淋球菌及链球菌等对本品高度敏感；脑膜炎双球菌、白喉杆菌、破伤风杆菌及梅毒螺旋体也很敏感青霉素高活性的β-内酰胺环与敏感细菌胞浆膜上靶分子青霉素酶结合蛋白（penicillin binding protein,PBPs）结合，呈现抑制转肽酶的转肽作用，阻碍黏肽合成的交叉联结过程，造成细胞壁缺损，由于敏感菌体内渗透压高，使水分不断内渗以至菌体膨胀，促使细菌裂解而死。

三：实验材料

四：实验内容

青霉素产出定性检测

1.培养基配制

发酵培养基：10%葡萄糖，%-5%麸皮，0.5%-0.8% 苯乙酸，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 •3H2O 0.5g，MgSO4•7H2O 0.5g，FeSO4•7H2O 0.01g，水1000ml pH6.4~6.8。分装入三角瓶中，112℃灭菌20分钟。

2.青霉素标液制备

准确称取注射用青霉素钾0.2009g无菌水中，然后移入250ml容量瓶中，无菌水