实验一 大肠杆菌基因组提取

在实验开始，首先对实验的一些必须步骤（注：在几乎每一次小实验都会使用到的试验方法）做一定的解释。避免在写实验报告的过程中太过混乱！并且这些过程并不是每一位同学都参与了的，故在本实验报告的开篇写出。

（一）制备1%的琼脂糖凝胶

称取1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100 mL的1 × TAE缓冲液，在微波炉中加热。完全融化后，取出摇匀。

（二）胶板的制备

1. 用橡皮膏将胶板的两端边缘封闭好。

2. 将胶板放在水平处，放好样品梳子。

3. 将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶缓慢倒入胶板中，注意不要产生气泡。胶的厚度在3-5mm之间。

4. 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放入电泳槽内（注意：梳子的方向靠近负极）。

5. 向电泳槽中加入1 × TAE缓冲液，缓冲液要浸没凝胶。

（三）加样

1. 在样品中加入适量的10 ×上样缓冲液，使缓冲液的终浓度为1×。

2. 用微量移液器将已加入缓冲液的样品加入上样孔中。记录加样的顺序和加样量。（注意：加样的过程中不要让样品溢出上样孔）

（四）电泳

1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意DNA片段是从负极向正极移动）。DNA 的迁移速度与电压成正比。最高电压不超过5V/cm。

2. 当溴酚蓝染料移动到凝胶的2/3处时，停止电泳。

（五）染色

将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中（带手套操作）。

（六）观察实验结果

在紫外灯（360 nm或254 nm）下观察染色后的凝胶，DNA处显出橘红色的荧光条带。

实验一大肠杆菌基因组提取

【实验目的】

1.学习并掌握细菌基因组的提取方法

【实验原理】

DNA是一个环形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内。不同种属的生物，以及不同形式的细胞（如菌类、培养细胞、植物组织，动物组织）基因组提取的方法是不同的，但其基本原则是类似的，即既要将DNA 与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

【实验材料】

大肠杆菌DH5α菌液

【实验试剂】

LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl， CTAB/NaCl 溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇

【实验仪器与用具】

微量移液器，低温离心机，水浴锅，eppendorf管，恒温摇床

【实验步骤】

（1）将2mL培养至对数期的大肠杆菌DH5α菌液5000rpm冷冻离心10min 弃上清；

（2）加190μL TE悬浮沉淀，并加10μL 10%SDS，1μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃保温1h；

（3）加30μL 5mol/L NaCl，混匀；

（4）加30μL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min；

（5）加入300μL酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提，5000rpm离心10min，将上清液移至干净离心管；

（6）加入300μL氯仿/异戊醇（24：1）抽提，取上清液移至干净管中；

（7）加300μL异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，沉淀DNA；

（8）5000rpm离心10min，沉淀DNA，加入500μL70%乙醇，5000rpm离心10min，弃乙醇，吸干；

（9）溶解于20μLTE，取3μL 用于琼脂糖凝胶电泳验证，其余-20℃保存。【实验结果与分析】

10 9 8 7 6 M

如图所示，8号为本组实验结果。对比maker,第一条带为正常大肠杆菌基因组，中间可以看见模糊的两条带，可能为断裂的基因组片段，下面最亮的为RNA。出现断裂的基因组可能是由于操作过于剧烈。本组电泳带还比较清晰整齐，其他组不整齐的带可能是电泳技术问题。RNA含量很大，所以出现拖尾现象。

实验二大肠杆菌感受态细胞的制备及验证

【实验目的】

1.掌握感受态的制备和转化的原理

2.学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法

3.为重组子的转化做准备

【实验原理】

本实验采用CaCl

2

制备大肠杆菌的感受态细胞。所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存。

在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl

2

等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl

2法）。其原理是细菌处于0℃，CaCl

2

的

低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

【实验材料】

大肠杆菌DH5α

【实验试剂】

LB液体培养基，0.1mol/Lcacl

2

溶液

【实验器材】

恒温摇床，超净工作台，高压灭菌锅，低温离心机，微量移液器

【实验步骤】

一、感受态细胞的制备