细胞培养技术++培训完整版

.
39
.
40
.
41
.
42
.
43
.
44
.
45
悬浮细胞
圆形，可以单个细胞或聚集成团生长；
细胞透亮，核、膜分界清楚；
可大量繁殖，镜下可见分裂期细胞； 肉眼可见在培养瓶中可沉底，轻轻晃动 后均匀分布；培养基清亮。 培养生长不好时，聚集成团的细胞少， 生长慢，细胞有皱缩、破碎、透光性降 低等现象。
back
.
21
抗生素液
链霉素 (100ug/ml) 青霉素 (100单位/ml) 制霉菌素 (100单位/ml) 终浓度不超过万分之一为宜
back
.
22
pH调整液
5.6%NaHCO2 HEPES 1NHCL 10%HAC 1NNaOH
.
back
23
无菌操作
洗手 着装 近火焰操作 试剂瓶等斜放
.
back
.
18
附加成分
促贴壁物：层粘连蛋白等 激素：胰岛素、氢化考的松、GH等 生长因子： ECGF、NGF、FGF等 酶抑制物：大豆胰旦白酶抑制剂等
back
.
19
平衡盐液
Hanks D-Hanks Earle PBS HBSS
.
back
20
消化液
胰蛋白酶 (0.125 -0.25%) 胶原酶 (0.1-0.3mg/ml) EDTA (0.01 -0.02%)
.
27
二、细胞培养的基本内容
细胞传代培养* 细胞冻存与复苏*
.
28
.
29
.
30
细胞计数
血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：自动计数 计算：以活细胞计数；成团细胞算一个
细胞数＝4大格细胞数/4×104个/ml 压线细胞计数原则：
数上不数下，数左不数右
.
31
.
32
.
33
常规观察
（3）低速离心5分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速 度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影 响。
.
57
结语
细胞培养是一件繁琐、细致的实验！需 要实验者具有缜密的思维及足够的耐心！ 谢谢聆听，共同学习！
.
58
.
53
细胞冻存和复苏
优点：细胞低温冷冻贮存是细胞室 的常规工作。细胞冻存与细胞传代 保存相比可以减少入力、经费，减 少污染，减少细胞生物学特性变化。
.
54
细胞冻存方法
配制冻存液： 20%血清培养基＋10% DMSO DMSO溶解要产热，应提前配，避免伤细胞。
DMSO的作用
收集对数生长期细胞，加入适量冻存液, 用吸 管吹打成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)
.
back
14
back
.
15
培养液
使用培养液： 天然培养基 5-20% 合成培养基 80-95% 附加成分 再加适量抗生素液，调整pH值即可
back
.
16
天然培养基
小牛血清 胎牛血清 组织提取液
back
.
17
合成培养基
RPMI1640 Eagle培养液：DMEM、MEM、IMDM HamF12、HamF10、 PC199 Mc-Coy5A
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋 系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每 分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至液氮表 面，停30分钟后，直接投人液氮中。
.
56
细胞复苏方法
（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃ 水浴中，使其融化（1分钟左右）。
（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以 上。
实验室条件： 环境、设备、器材、试剂
实验操作者工作范畴： 无菌操作、温育、培养液配
置、洗刷、无菌处理、细胞和用品 储存等
back
.
4
实验室条件
无菌环境 仪器设备 普通器材 一般试剂
.
5
无菌室结构模式图
back
.
6
仪器设备
超净工作台、二氧化碳培养箱、 倒置显微镜、液氮罐、低温冰箱、 重蒸水装置、负压真空泵、普通冰 箱、消毒锅、烤箱、水浴锅、天平 等
加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细 胞名称和冷冻批号。
.
55
慢冻程序
原则：当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min；当温度 达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min；当温度达-100℃时， 可迅速放入液氮中。 GMP程序：
将冷冻管（管口朝上）放入纱布袋内， 4°冰箱 0.5h；－20°冰箱0.5h；－70°冰箱0.5h；转入液氮。 简易程序：
.
36
细胞的生长状态
贴壁细胞 随贴附支持物形状不同而形态各异，最常
见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下 生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。
细胞在生长期常有1-2个核仁，在细胞机能 状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。
若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等， 表明细胞代谢不良。
.
37
.
38
细胞培养技术
Cell Culture
病理（肾脏）实验室 白洁
.
1
细胞培养
概念：取动物组织，在体外，无菌条
件下，模拟体内环境（营养、温度、 pH值、气体），对其进行培养，使 细胞能够生存、生长、保持原来生 物学特性的一种实验方法。
.
2
内容
细胞培养的基本条件 细胞培养基本实验
.
3
一、细胞培养的基本条件
培养液：
颜色：含有指示剂酚红，颜色反应PH值
新鲜的正常：PH7.2～7.4，桃红色； 培养后，细胞产酸，变黄，需换液；
透明度：清亮透明，混浊多为污染（悬 浮细胞除外）
.Fra Baidu bibliotek
34
.
35
培养液短期内变黄：
1、是否有细菌污染； 2、可能培养皿没清洗干净，有残留物； 3、细胞生长太快； 4、细胞接种量过大。
back
.
7
二氧化碳培养箱
.
back
8
超净工作台
.
back 9
倒 置 显 微 镜
back
.
10
液 氮 罐
.
back
11
普通器材
玻璃瓶皿：玻璃瓶、培养瓶、培养 皿、吸管、离心管、抽 虑瓶等
塑料瓶皿：多孔培养板、培养皿、 培养瓶等
.
12
back
.
13
一般试剂
培养液 平衡盐液 消化液 抗生素液 pH调整液
.
46
.
47
.
48
微生物污染
传代或换液后24h～48h可观察到； 细菌、真菌污染的典型表现：培养液混浊，液 体内漂浮有菌丝或细菌； 支原体污染：不明显，细胞生长明显变缓，胞 质内颗粒增多，有中毒表现，但培养液多不发 生混浊。
.
49
.
50
.
51
.
52
细胞冻存与复苏
细胞冻存（缓慢） 细胞复苏（快速） 冻存和复苏的原则：慢冻快融
24
实验前准备
清洗： 玻璃、塑料、橡胶、金属类等 消毒： 无菌室、培养用液、培养器皿 （玻璃、塑料、橡胶、金属）等
.
25
清洗示意图
白箭头：玻璃制品 黑箭头：橡胶制品
.
back
26
消毒方法
物理消毒法：射线、紫外线、干热、 湿热、过滤、煮沸等
化学消毒法：乳酸、甲醛、过氧乙 酸、新洁尔灭、乙醇等
抗生素灭菌