实验五 离子交换柱层析法分离氨基酸

根据分离过程的实验条件 强酸强碱—应用广泛 弱酸型—只能在碱性pH范围内使用 弱碱型—只能在酸性pH范围内使用
（二）缓冲液的选择 原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样品 一致。避免使样品变性
(三)洗脱剂 原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼 的离子或基团 改变pH或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力 降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱
目的要求
（ 1）学习采用离子交换树脂分离氨基酸的基
本原理。
（2）掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。
一、原理
离子交换层析是用离子交换剂（具有离子
交换性能的物质）作固定相，利用它与流动 相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离 子型化合物的层析方法。 即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团 交换反应的过程。
件下氨基酸从层析柱洗脱下来的顺序。
Separation of amino acids on a cation exchange column
注意事项
在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液 面在树脂表面以下等现象发生。

pH4.2 pH
Asp >10
Lys
[器材]
1. 2. 层析柱等 沸水浴
[试剂]
Dowex50
2mol/L
NaOH pH5.3柠檬酸缓冲液 样品液：氨基酸混合液 茚三酮混合液
Fra Baidu bibliotek
实验步骤
1．树脂的处理
将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4 倍体积
的2mol/L的盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氢氧 化钠处理，做法同上。最后用欲使用的缓冲液浸泡。 2．装柱 取直径1cm,长度10－12cm的层析柱。将柱垂直至于铁架上。自顶 部注入上述经处理的树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，

放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至8 ~ 10cm的高度即可。 装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整。液面不低于树脂。
3．平衡
将缓冲液瓶与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，树脂表面 保留3－4cm液层，开动衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH与洗
脱液相同。
4. 加样
目数：离子交换树脂的颗粒直径大小
Dowex 50 为20-50目 Dowex 20 840m 50 297m 100 149m （代表二乙烯苯的百分含量）
树脂resin（据所含交换基团的性质分） 阳离子交换树脂 强酸型 含磺酸基团 (R-SO3H) 中等酸型 含磷酸基团 (-O-PO2H4) 弱酸型 含酚基、羧基 阴离子交换树脂 强碱 含季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离 子交换树脂稳定。
三、操作注意点
（一）离子交换剂的选择 原则：根据被分离物质的性质选择 —同一性质 离子交换剂中选用对被分离物质各组分之间 结合力差异大的型号交换剂，以保证通过离 子交换层析后能得到比较满意的结果。
考虑因素： 1.被分离物质带何种电荷 2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素 3.被分离物质所处的环境 4.被分离物质的物理化学性质 5.被分离物质的大概数量

（二）按载体种类不同 1.离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂 苯 乙 烯 + 二 乙 烯 苯 聚 苯 乙 烯 （单体）（交联剂） 二乙烯苯 交联度 = ———————— × 100% 苯乙烯 + 二乙烯苯
交联度大，网孔变小，大分子量的离子不能
进入树脂颗粒内发生离子交换。 在不影响分离的情况下，以采用交联度较高 的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选 择性 。
揭去层析柱上口盖子，待柱内液面至树脂表面1－2mm关闭出口，沿管壁四周小 心加入0.5ml样品，慢慢打开出口，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树 脂顶端时，即刻加入少量柠檬酸缓冲液冲洗加样品处数次，然后注入柠檬酸缓冲 液至液面高3－4cm左右，接恒流泵。
5. 洗脱
以缓冲液洗脱，开始用试管收集洗脱液，每管收集1mL，共收集60—80管。
6．洗脱及氨基酸的鉴定
向各管收集液中加 1mL 水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中准确 加热5min后冷却至室温，再加入3mL的0.1%硫酸铜溶液。混匀，以收集液第 2 管为空白，测定A570波长的光吸收值，以光吸收值为纵坐标，以洗脱液体积为
横坐标绘制洗脱曲线
。
实验结果
根据氨基酸的解离性质，分析该实验条
带电荷量少，亲和力小的先被 洗脱下来，带电荷量多，亲和力大 的后被洗脱下来。
离子交换过程示意： 起始 吸附 解吸 x+ : 起始缓冲离子 y+ ：待分离离子 z+ ：待分离离子
完成
二、离子交换剂的种类
在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离 子交换剂。 （一）按活性功能基团带电荷性质不同 阳离子交换剂 — 带负电荷，与阳离子交换 阴离子交换剂 — 带正电荷，与阴离子交换
与水含茚三酮的反应：
O OH OH O O －CO2 O O RCHO + O O H N O O H NH2 O R N CH2 O OH OH O O O O H N O O O H R N CH H2O R CH COOH + NH2 －2H2O O O R N CHCOOH
紫色物质，用于α－氨基酸的比色测定和纸层析显色
2.离子交换纤维素 阴离子交换纤维素 — 如 :DEAE- 纤维素 pH8.6以下分离中性或酸性物质,具二乙胺 乙基 阳离子交换纤维素—如:CM-纤维素 一般 pH>4条件下使用,具有羧甲基
3.离子交换凝胶— 分离大分子物质 如 ： 葡 聚 糖 （ Sephadex ） 、 聚 丙 烯 酰 胺 （PAG）、琼脂糖（Sepharose）
四、应用
分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他 带电的生物分子
离子交换层析法分离氨基酸及测定
[原理]
所用样品为天冬氨酸和赖氨酸的混合液， 分 别 属 酸 性 氨 基 酸 (pI2.77) 、 碱 性 氨 基 酸 (pI9.74) ，在缓冲溶液中分别带正电荷和负 电荷，与强酸型阳离子交换树脂 Dowex50亲 和力有很大不同，在一定的洗脱条件下洗脱， 将它们分离。利用氨基酸可与茚三酮反应生 成有色化合物进行氨基酸鉴定。