果胶酶活性测定实验报告

一、实验设计

实验序号实验三实验名称特定产物工业生产菌种发酵

试验时间2010年13日-23日实验室基础生物2（121）

一、实验目的

1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；

2、了解酶学性质的研究.

3、了解影响果胶酶对果汁澄清效果的各种因素

二、实验与原理

1、果胶酶概况

（1）、果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。

（2）、果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。

（3）、产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌。

（4）、果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。

2、果胶酶的酶活测定方法

（1）、粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。

（2）、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。

（3）、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。

（4）、还原糖法（DNS法）：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。

3、微生物发酵生产产品受以下条件制约：

（1）、培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子

（2）、培养条件：温度、pH、溶解氧等

（3）、附加条件：诱导物、表面活性剂等

4、酶催化反应的进行受多种因素的影响：底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂、抑制剂

三、设备与材料

（一）、培养基

1、菌种筛选使用培养基

（1）、基本培养基:

果胶1% 、磷酸氢二钠0.5%、蛋白胨1%、pH4.5、琼脂2.0%。

（2）、分离培养基：

果胶0.5%、磷酸氢二钠0.5%、琼脂2.0%、H4.5。

（3）、发酵培养基

果胶1%、磷酸氢二钠0.5%、蛋白胨1%、pH4.5。

2、黑曲霉Asp-2固体发酵培养基

菌种斜面培养基（查氏培养基）：NaNO3 0.2%、K2HPO4 0.1%、KCl0.05%、MgSO4 0.05%、FeSO4 0.001% 、蔗糖 3%、琼脂2.5%、自然pH。

3、种子培养基：

麸皮3.0% 、橘子粉2.0%、硫酸铵0.5%、葡萄糖1%、KH2PO4 0.1%、pH4.5。

4、固体发酵培养基：

麸皮 10g、橘子粉 2.5g、(NH4)SO4 0.1g（0.8%干料计）、葡萄糖0.125g（1%

干料计）、水15ml。

（二）、试剂

1、酶活测定使用试剂

（1）、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸15.652g，柠檬酸钠7.5g，溶解定

容至1000ml，用0.1M NaOH 或0.1M HCl 调节pH至3.0。

（2）、底物——0.25%果胶溶液：称取0.25g果胶，用上述缓冲液溶解，在电炉

上加热至完全溶解，用缓冲液定容至100mL，储存于4℃，7天内有效。

（3）、DNS试剂：称取酒石酸钾钠182.0g、溶解于500 mL水中，加热（不超过

50℃），于热溶液中依次加入3-5 二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g，苯酚5.0g，无水硫酸钠5.0g，搅拌均匀至溶解，冷却后定容至1000 mL，储存于棕色瓶中，室温保存，7~10天后过滤使用。

（三）、仪器

（1）、烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等；（2）、天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器（精确到秒）、分光光度计等。

四、实验方法步骤

（一）、果胶酶产生菌的分离——稀释涂布平板法

1、菌种的采集

要获得产生果胶酶的菌种，可从富含果胶酶作用底物的场所去采集。胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛果胶酶时，只要到相应的环境中采样即可。（果树下面的土壤里）

2、倒平板

配制分离培养基高压灭菌30min 冷却至约50℃倒5～6块平板/100mL 冷却备用

3、制备土壤稀释液

（1）称取土样10g，放入90mL无菌水中（带玻璃珠），摇动10min，静置10min,制备得到10-1土壤稀释液；

（2）用无菌吸管吸出1mL土壤悬液，加入盛有9mL无菌水的大试管中，充分混匀，制备得到10-2土壤稀释液；

（3）再从中吸出1mL加入盛有9mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3土壤稀释液；

（4）以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。

4、、涂布

用无菌吸管分别吸取10-3、10-4、10-5 、10-6 和10-7土壤稀释液各0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀。

5、富集培养

采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，

而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。培养时控制培养的温度、pH和营养成分等。

6、菌种的分离

培养基里含有果胶，能利用该底物生长的菌种就是所需要的产果胶酶菌种。7、纯化

挑取其中透明圈较大的单菌落，划线于平板，37℃倒置培养2～3d；

如发现杂菌需再一次进行纯化直到获得纯培养。

（二）、果胶酶产生菌的发酵

1、配置发酵培养基40mL/瓶。

2、分别挑取细菌和霉菌菌落接种于发酵培养基中。

3、37℃、 200r/min摇瓶发酵约72h。

（三）、果胶酶的活性测定

（1）、待测酶液的制备

将发酵液离心，取上清液用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释10倍

（2）、制作标准曲线

半乳糖醛酸溶液（ml）0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 半乳糖醛酸（mg）0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 缓冲液（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 DNS (ml) 3 3 3 3 3 3 3

定容总体积(ml) 20 20 20 20 20 20 20 OD（540nm）

（3）、酶活的测定

操作步骤空白管样品管A 样品管B

步骤1 吸取1.8mL果胶底

物溶液吸取1.8mL果胶底

物溶液

吸取1.8mL果胶底

物溶液

步骤2 37℃保温5分钟37℃保温5分钟37℃保温5分钟

步骤3 加入待测酶液0.2ml 加入待测酶液0.2ml 步骤4 37℃精确保温30min 37℃精确保温30min 37℃精确保温30min 步骤5 加入3mLDNS试剂终加入3mLDNS试剂终加入3mLDNS试剂终