β-珠蛋白基因(β-Globin gene ) 多态性分析

β-珠蛋白基因(β-Globin gene ) 多态性分析

1.1实验目的

制备人染色体DNA以及测定DNA的浓度和纯度。

1.2 实验原理

1. 人体内各种组织细胞的染色体DNA都携带有全身的遗传信息。因此，可以从口腔粘膜脱落细胞中制备人的染色体DNA，然后分析目的基因的结构及多态性。

2. 基因组DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在。结合力：氢键，离子键等。可以使用以下三种方法破坏这些结合力：

（1）一般采用去污剂、蛋白质变性剂、蛋白酶等裂解细胞并使核酸与蛋白分开。

（2）去除蛋白质通常采用有机溶剂酚和氯仿

（3）用乙醇、异丙醇、等有机溶剂对水相中的核酸进行沉淀

3. DNA 、RNA所含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键有吸收紫外光的性质，吸收峰在260nm，可用紫外分光光度法测定DNA的浓度

1.3方法步骤

1. 处理材料（细胞采集）：

（1）选材：口腔粘膜脱落细胞

（2）方法：口腔拭子（消毒后的棉签擦拭两侧脸颊各10次），将在面颊内擦拭过的棉签转置于2ml离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆上剪下，加入400μl缓冲液GA。

注意：为了保证样本不被食物或者饮料污染，取样前30分钟内请勿进食和饮水。

2. 加入20μl蛋白酶K溶液，涡旋10秒混匀，56℃放置60分钟，其间每15分钟涡旋混匀数次。

3. 加入400μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，此时溶液应变清凉，简短离心以去除管盖内壁的液滴。用镊子将棉签挤干后取出。

注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。

4. 加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。

注意：加入无水乙醇后可能会出现絮状沉淀，但不影响DNA提取。

5. 加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。

注意：加入无水乙醇后可能会出现絮状沉淀，但不影响DNA提取。

6. 向吸附柱CR中加入500μl缓冲液GD（使用前先确认是否已加入无水乙醇），12000rpm(~13400g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。

7. 向吸附柱CR中加入700μl漂洗液PW（使用前先确认是否已加入无水乙醇），12000rpm(~13400g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。

8. 向吸附柱CR中加入500μl漂洗液PW，12000rpm (~13400g)离心30秒，倒掉收集管中的废液。

9. 将吸附柱CR放回收集管中，12000rpm(~13400g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CR 室温放置数分钟，以彻底凉干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：这一步目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

10. 将吸附柱CR转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-40μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟，12000rpm(~13400g)离心2分钟。

注意：洗脱缓冲液TB体积不应少于20μl，体积过小影响回收效率。

11. DNA浓度及纯度检测

（1）浓度：TB调零（blank），测样品浓度

（2）纯度：1.8≤OD260/OD280＜2.0

基因组DNA或者GC分布不均匀的线性双链DNA因呼吸作用（富含AT区段双链与单链的动态平衡）产生的局部单链区会使OD260偏高，OD260/OD280的比值为1.8-2.0。纯净，完整的双链DNA OD260/OD280 为1.8。值偏低，提示蛋白质含量高；值偏高，提示盐残留。

1.4 结果

浓度：68.8ng/μl

纯度：1.84

1.5 讨论分析

从结果可以看出，本组实验所提取的口腔黏膜细胞的染色体DNA纯度在1.8-2.0之间。提示样品较为纯净，未受其他物质的污染。结果可信。