原生质体培养方法

Semi-permeable membrane on solid medium
Semi-permeable neration in citrus protoplast culture

琼脂糖珠培养:Agarose bead culture
影响原生质体培养的主要因素
基因型
– 番茄与秘鲁番茄有性杂交后性状分离的遗传分析表明，其愈伤组 织再生能力受2个显性基因决定(Koornneef等1987)。Cheng和 Veilleux(1991)对芙薯(S. phureja)原生质体培养能力进行遗传 分析，证明从原生质体培养到形成愈伤组织受2个独立位点的显性 基因控制(Cheng等1991) – Dudits等（1991）以苜蓿不同基因型深入研究，表明某个基因 型在离体培养时难以形成体细胞胚。若将对激素调节有作用的发 根农杆菌rolB和rolC基因引入并表达，可能促使其体细胞胚形成
3. 愈伤组织形成
1）多数情况下，原生质体培养2周 后，可形成多细胞团，3周后形成肉 眼可见的小细胞团，5-6周后形成直 径1 mm的小愈伤组织 2）原生质体培养15-20天后，需要及 时添加新鲜培养基，同时降低渗透 压，否则细胞团不会继续生长。待 小愈伤组织长至1 -2mm时，应及时 转移至固体培养基使其进一步生长

固体平板培养:Solid culture
固体培养也就是琼脂糖包埋培养。低融点琼脂糖可在 30 C左右融化与原生质体混合而不影响原生质体的生 命活动。混合后的含有原生质体的培养基铺于培养皿 底部，封口后进行培养
优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于 统计原生质体分裂频率
缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必须 合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则 琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀
–原生质体培养数小时后新壁开始形成，先是质膜合成形成细胞壁主要成分
的微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多片层的结构，之后在 质膜与片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团， 最后形成完整的细胞壁
–只有能形成完好细胞壁的再生细胞才能进入细胞分裂阶段
2. 细胞分裂和生长
原生质体培养数天后，胞质增加，细胞器增殖，RNA、 蛋白质及多聚糖合成增加，不久即可发生核的有丝分裂及 胞质分裂 原生质体一般培养2～7 d开始第1次分裂，但第1次分裂 的时间随植物种类、分离原生质体的材料、原生质体质量、 培养基成分和培养条件而异 用幼苗下胚轴和子叶、幼根、悬浮培养的细胞、未成熟种 子的子叶等分离原生质体，一般比用叶肉分离原生质体容 易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快
4.植株再生
原生质体培养再生的愈伤组织可直接转移到分化培养基，一步成苗 （器官发生）。愈伤组织也可通过体细胞胚发生，先形成胚状体，再 诱导生芽、生根。不同植物种属，其再生方式不同
仙客来原生质体的再生
香蕉原生质体再生—Assani等2006
看护培养
Sugarbeet （糖 甜菜）callus and protoplast regeneration

液体－固体双层培养:Liquid solid culture
即在培养皿底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生 质体悬浮液滴于固体培养基表面 优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体 培养基，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性 炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进 原生质体的分裂和细胞团的形成 缺点：不易观察细胞的发育过程
原生质体培养方法
液体浅层培养 固体平板培养
固-液体双层培养
琼脂糖珠培养

液体浅层培养:Liquid thin layer culture
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封 口后进行培养 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加 新鲜培养基和转移培养物 缺点：原生质体分布不均匀，常发生原生质体粘连现 象而影响其进一步生长和发育；难以跟踪观察某一个 细胞的发育情况；一旦污染，全皿报废

起始培养密度与培养基
–起始培养密度：适宜密度为1-5×105/ml –培养基激素水平：柑橘不添加外源激素，也可再生 –培养基营养成分完全性：越丰富越好
Protoplast density counting
25格 × 16格（0.1 mm3）的血球计数板计算公式：原生
质体细胞数 / ml = 80小格（左上、右上、左下、右下、中5个中格）内
原生质体细胞个数/80 × 400 × 104 × 稀释倍数
1 ml = 1 cm3 = 1000 mm3
三、原生质体再生植株遗传及变异
将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约 50 l一滴的量滴于直径6 cm的培养皿，待其固化后向 其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养 (Thompson等，1986)。培养过程中，通过调整液体培 养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步 的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和 营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形 成

原生质体来源
供体材料类型：向日葵幼叶、子叶和下胚轴原生质体培养，只有下胚轴
原生质体培养得到了细胞团和体细胞胚，而幼叶和子叶原生质体均未获得成 功 供体细胞的分化程度：同一个基因型的植株生长在不同的环境条件下，其 生理状态会有改变。供试植株最好生长在控制条件下，以提高原生质体的细 胞分裂频率和再生能力，并且可提高实验重复性 柑橘：叶肉原生质体无论单独培养还是共培养均不能再生，只有胚性愈伤 组织来源的原生质体才能再生
原生质体发育与植株再生
细胞壁再生
细胞分裂与生长 愈伤组织形成 植株再生
1. 细胞壁再生
–原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整细
胞壁
–新合成的细胞壁可用0.1％荧光增白剂（Calcofluor）染色后在荧光显微
镜下观察，可见到绿色荧光围绕细胞表面，证明细胞壁已形成。也可用高 渗溶液产生质壁分离的方法、电子显微镜观察技术和冰冻蚀刻法等进行再 生细胞壁的研究