蛋白质电泳实验

尿素－SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

1．试剂的配制

①30%凝胶母液

丙烯酰胺和N, N’-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29.2 %（w/v）丙烯酰胺和0.8 %（w/v）N, N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。

小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。

②4倍SDS分离胶缓冲液(4×, pH 8.8) (200 ml)

称取SDS 0.8 g (4%)，Tris 36.342 g (1.5mol/L)，溶解（必要时加热），用盐酸调pH 为8.8，定容至200 mL。

③4倍SDS浓缩胶（堆积胶或积层胶）缓冲液。(4×，pH 6.8)（100 ml）

称取SDS 0.4 g (4%)，Tris 6.051 g (0.5mol/L)，溶解（必要时加热），用盐酸调pH为

6.8，定容至100 mL。

④TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)。

TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

⑤10%过硫酸铵。

0.5 g过硫酸铵溶于5 mL去离子水中，可于4 ℃下存放数月

⑥Tris-甘氨酸电极缓冲液（1 L）

称取3g Tris （25 mmol/L）,14.4 g甘氨酸 (192 mmol/L),1 g SDS（0.1 %），溶解后定容至1L，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液在室温下长期保存。

⑦样品处理液（5×样品缓冲液）（10 mL）

称取Tris 0.07266 g Tris (60 mmol/L), SDS 0.02 g (2%, W/V), 溶于4 mL水中, 用HCl小心调节pH为6.8,再加5 mL 50%的甘油 (终浓度25%, V/V)，0.5 mL 2-巯基乙醇(14.4 mmol/L)，溴酚蓝0.01 g (终浓度0.1%), 加去离子水至10 mL。可以在4℃下存放数周，或在－20℃下保存数月。

⑧考马斯亮蓝R250染色液（1000 mL）

0.1% 考马斯亮蓝 R250

考马斯亮蓝R-250 1.0 g （0.1%, W/V）

无水乙醇450 mL (45%, V/V)

冰醋酸100 mL (10%, V/V)

加水定容至1000 mL

⑨脱色液（1000 mL）

无水乙醇 100mL (10%, V/V)

冰醋酸 100mL (10%, V/V)

加水定容至1000 mL

2．尿素－SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制

⑴根据厂家说明书安装玻璃板。(琼脂封口)

⑵确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定

体积的分离胶溶液。(一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。)

配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳15 %分离胶溶液（20mL/电泳板, pH8.8)水 2.4mL

尿素 7.2g

分离胶缓冲液 5mL

30%凝胶母液 4. mL

混匀后, 加入10% AP 100 µL, TEMED 10 µL, 迅速混合。

⑶迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加

0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水（约2~3 mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液

⑷分离胶聚合完全后（约30~60分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。

⑸制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺

溶液。（一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。）配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液（10 mL/电泳板，pH6.8）水 5.75 mL

浓缩胶缓冲液 2.5 mL

30%凝胶母液 1.75 mL

混匀后, 加入10% AP 66 µL, TEMED 10 µL, 迅速混合。

⑹聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气

泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。

⑺在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按4:1体积比加入样品处理液，在

100℃加热3~4分钟以使蛋白质变性。

⑻浓缩胶聚合完全后（30~60分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各

加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。

⑼按预定顺序加样，加样量通常为10～25μL（1.5 mm厚的胶）。

⑽将电泳装置与电源相接，凝胶上所加恒电流为10 mA。当染料前沿进入分离胶后，把电流提高到15 mA，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约0.5 cm，然后关闭电源。

⑾从电泳装置上卸下玻璃板，轻轻撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去

一角以标注凝胶的方位。

3．用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色

经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色

染色1～2小时或过夜。

脱色液：脱色需3～10小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。

此方法检测灵敏度为0.2～1.0g。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内

而不降低染色强度。为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。

如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！