免疫检测法

适用于
优点
注意
特异性高 不能检测小分子抗原及半抗原 双抗体夹心法测 是检测抗原最 3. 与固相抗原的竞争结合 抗原 常用的方法， 适用于检验各 取稀释板中预孵育的抗原抗体混合液 100μl，加入 种蛋白质等大 酶标板的抗原孔中，放入 37℃恒温培养箱中60 min。洗 分子抗原
板3次。
双抗原夹心法测 抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的 纯化抗原时，可用此法检验特异性抗体
实验前准备：
制备纯化抗原或抗体 制备抗原或抗体包备液包被微孔板 制备酶标记抗体或抗原 制备酶催化底物 终止液

实验步骤：
1.加样：加待检样品0.05ml于已包被之反应孔中，置37℃孵育 30分钟。 (设置空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔各加 0.05ml对照标准)。 2.洗涤,新鲜配置洗涤液注满微孔, 停滞15秒弃去.重复5次. 3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴 定后的稀释度)0.05ml。37℃孵育30分钟. 4.洗涤,新鲜配置洗涤液注满微孔, 停滞15秒弃去.重复5次. 5.加底物液显色：于各反应孔中加入底物A液和底物B液各 0.05ml，置37℃孵育15分钟。 6.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 7.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内 颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测 O· D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调零后测各孔O· D值， 若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
酶联免疫法 ELISA
实验材料
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 在这种测定方法中有3种必要的材料： 1.固相的抗原或抗体 2.酶标记的抗原或抗体 3.酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性 状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类 型的检测方法。 4.相应的检测仪器.
竞争法测抗原
◆如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固
相抗体结合。
◆如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的
机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原 与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体 的结合量减少。
相抗体的结合最充分。
◆参考管中只加酶标抗原，孵育后，酶标抗原与固
竞争法测抗体

当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得 到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗 体。 标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相 抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上 的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性 反应。
实验操作：
固定OD值
三、操作步骤
1.
包被抗原
抗原用包被液（CBS）稀释至合适浓度，加入到酶标板 中，100μl/孔，放入湿盒中，4℃过夜。
抗原100ul/孔
酶标板
湿盒中，4℃过夜
次日，用洗板液洗板3次（将洗板液加入每孔，1min后倾去），以洗去未包 被的游离抗原。
2.
抗原与抗体的预孵育
制作标准曲线： 在稀释板中，用PBS倍比稀释标准抗原，每种浓度 的抗原最终为50μl，分别在各抗原孔中加入250μl一定 浓度的抗体，放入37℃恒温培养箱中30 min。 待测抗原： 取50μl未知浓度的抗原按照同上操作。 250ul抗体
免疫酶技术

免疫酶技术(enzyme immunoassay)： 是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催 化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗 原或抗体的一种免疫学标记技术。 常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）。
基本原理

①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫 活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶 标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测 定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原 或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他 物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物 质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催 化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相 关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由 于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使 测定方法达到很高的敏感度。
亲和素-生物素-ELISA法
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。每个分 子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结 合。 生物素（biotin）又称维生素H，存在于蛋黄中。 可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形 成生物素化的产物。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特 异性强，亲和力大，形成一种极为稳定的复合体。 把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大 提高ELISA的敏感度。

捕获包被法测抗体

样品中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性 IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。 因此测定IgM抗本多用捕获法。 先将所有样品IgM（包括特异性IgM和非特异 性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定 特异性IgM。

操作步骤如下
（1）将抗IgM抗体连接在固相载体上，形成固相 抗IgM，洗涤。 （2）加入稀释的待测标本：孵育后样品中的IgM 抗体被固相抗体捕获，洗涤。 （3）加入特异性抗原试剂：其仅与固相上的特异 性IgM结合，洗涤。 （4）加入针对抗原的酶标抗体：使之与结合在固 相上的抗原反应结合，洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示标本中 存在特异性IgM抗体，是为阳性反应。
间接法测抗体 100ul
只要变换包被抗原就可 利用同一酶标抗抗体建
立检测相应抗体
1.关键抗原的纯度 2.另一种干扰因素为正常血清中所
含的高浓度的非特异性抗体
酶标板 竞争法测抗原 快，只有一次保温洗 需要较多的酶标记抗原 涤过程 37℃，60 min
洗板3次
方法 竞争法测抗体
适用于
实验材料：

羊抗人血清白蛋白抗体（一抗） 已知含量的人血清白蛋白（作标准曲线） 待检人血清白蛋白 捕获包被法测抗体 主要用于 血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定 辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体（二抗） 包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液 洗板液或稀释液：PH7.4，0.01mol/L PBS 底物溶液： OPD-H ABS-ELISA 法 ABS-ELISA 2O2 较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤， 在临床检验中ABS-ELISA应用不多。 终止液：2mol/L H2S04 酶标反应板（一条/人）
乙肝标志物中 受检标本不需稀释， 抗HBs的检测常 可直接用于测定，因 采用本法 此其敏感度相对高于 间接法
是检测抗体最常 用的方法,本法主 要用于对病原体 抗体的检测而进 行传染病的诊断
小分子抗原如激 素和药物等 ELISA测定多用 此法。
关键在于酶标抗原的制备，应根 据抗原结构的不同，寻找合适的 稀释板 标记方法。
免疫酶技术及其应用
——ELISA
酶联免疫法 ELISA
50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射性免疫 （RIA）分析技术之后，70年代初又建立了用酶来标记 抗原或抗体的分析技术 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体 液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附 测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 。它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶 技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展 起来的一种免疫测定技术 。

双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检 测相应的抗体。 此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定。 乙肝标志物中HBsAb的检测常采用本法。关 键在于根据抗原结构的不同制备酶标抗原。

间接法测定抗体
间接法的特点

本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病 的诊断。 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一 酶标抗体检测相应抗体。 间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注意 除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。若抗 原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被 效果。

检测方法
1。夹心法 双抗体夹心法测抗原（常用） 双抗原夹心法测抗体 2。间接法测抗体（常用） 3。竞争法 竞争法测抗原 竞争法测抗体 4。捕获包被法测抗体 5。亲和素-生物素 ELISA法
双抗体夹心测抗原
双抗体夹心测抗原
待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位，其 一端与包被于固相载体上的抗体结合，另一端 与酶标记的特异性抗体结合。 此法适用于检验各种二价或二价以上的大分子 抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。 不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子单 价抗原的测定。


竞争法测抗原
竞争法测抗原
（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。 洗涤。 （2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混 合溶液，使之与固相抗体反应，孵育洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原 最多，故颜色最深。待测管颜色越淡，表示标本 中抗原含量越多。参考管颜色深度与待测管颜色 深度之差，代表受检标本抗原的量。
免疫标记技术

Βιβλιοθήκη Baidu
免疫标记技术（immunolabelling technique）: 是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂 或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原 进行的抗原抗体反应。 特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定 位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技 术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫 测定
100ul 标准抗原
50ul
50ul
稀释板
50ul 稀释液
待测抗原 50ul
37℃，30 min
PBS 50ul