第四章 固定化技术

2）微囊型包埋法 （microencapsulation） 又称半透膜包埋法
是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内， 制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只
有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm。 半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透膜孔径 的小分子底物和产物可以自由进出，被称为 “人工细胞”。
2）偶联方法：
偶联成功与否取决于：
•载体：功能基团：芳香氨基，羟基， 羧甲基等。 •酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯 基，羟基，酚羟基，咪唑基。
制备方法：
由于载体上的功能基团与酶分子上的侧
链基团间不具有直接反应的能力，因此在偶
联反应前，需先进行载体活化，在载体上引
进某种活泼基团，然后此活泼基团再与酶分
较难 强 高 难 强 低 较难 强 中等
制备难易 结合程度 活力回收
高，酶易流失 高
再生 费用
可能 低
可能 低
不变
不能 低
不变
不能 高
可变
不能 中等
可变
底物专一性 不变
（二）细胞的固定化方法
基本概念
固定在载体上，并在一定空间范围内进 行生命活动的细胞，称为固定化细胞。固定 化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢， 故又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。 微生物、植物和动物细胞都可制成固定化细 胞。
无机吸附剂的吸附容量一般很低，多在 1mg蛋白/g吸附剂。 有机吸附剂的吸附容量一般较高，
2）离子结合法（ion binding）：离子交换剂的吸附 容量一般大于物理吸附剂 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM纤维素
优点：条件温和，操作 简便，酶活力损失少。 缺点：结合力弱，易解 吸附。
子上某一基团反应形成共价结合。
常用的偶联反应有：重氮化法、叠氮法、
溴化氰法、烷基化法等。
① 重氮法：
这是带芳香族氨基载体的主要反应，即 载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，然后再 在温和的条件下和酶分子上相应的基团如酚羟 基、咪唑基或氨基直接进行偶联。
② 叠氮法：
此反应适用于含羟基、羧甲基等的载体，
与酶的氨基、酚羟基或巯基等偶联。 反应产物带正电荷， 易于中性或碱性酶偶联固定。
•优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱
落，可连续使用。
•缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空
间构象而影响酶的催化活性。
①严格控制反应条件，提高反应的专一性。
例如：使反应局限于α-氨基，保护ε-氨基；
② 应用可逆抑制剂或底物，封闭或牵制酶的活性中心与必需 基团，避免试剂影响酶的活性构型和相应基团。
第二节 固定化酶和固定化细胞
的性质与表征
一、固定化酶的性质 影响酶催化活性的因素 1. 构象改变或立体屏蔽以及微扰 2. 微环境影响： 分配效应和扩散限制效应
1. 构象改变或立体屏蔽
构象变化：酶的活性中心或变构中心的构象发生变化。 立体屏蔽效应：由于载体对酶的活性中心或变构中心造成 空间障碍，因而底物或效应物与酶无法接触，从而影酶的 活性。
二、固定化酶和固定化细胞的特点
1、固定化酶的特点
优点：
(1)可提高稳定性。
(2)能回收，易与产物分离，可反复使用。
缺点：
(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。
(2)酶活性下降。 (3)首次投入成本高。
2、固定化细胞的特点 优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系 完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法
固定化方法
吸附法
共价偶联法
交联法
包埋法
物理 吸附法
离子交 换吸附
网格型
微囊型
1.吸附法（adsorption）
依据带电的酶或细胞和载体之间的静电
作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交
换剂上。
根据吸附剂的特点分:
1）物理吸附法（physical adsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、 硅胶、羟基磷灰石、纤维素（有机吸附剂）等。
③
溴化氰法：
带羟基的多糖类载体如纤维素、葡聚糖和琼脂糖等常
用的反应。在碱性条件下载体羟基和溴化氰反应生成极活 泼的亚氨基碳酸酯，它在弱碱中可直接和酶的氨基进行共 价偶联反应。
⑴ 活化
(2) 偶联
异脲键
④ 烷基化法：
含羟基的载体也可在碱性条件下和三氯三嗪
(triazinyl)等多卤代物反应，在引入活泼的卤素后能直接
3. 产物中混杂酶蛋白 , 产物分离纯化困难。
一、什么是固定化酶/固定化细胞？
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术 水不溶性酶/细胞 （固定化酶/细胞）
固定化生物技术——
是通过化学或物理的方法，用固体材料将 游离的酶或细胞束缚或限制于一定区域内，但 仍具有催化活性、并可回收及重复利用的一类 技术。
（二）细胞的固定化方法
1.固定化细胞的分类
分类方式 固定化细胞 分类方式 固定化细胞
细胞类型 微生物
植物 动物
生理状态 死细胞:完整细胞,细胞碎片, 细胞器
活细胞:增殖细胞,静止细胞, 饥饿细胞
2. 固定化方法
1) 直接固定法
不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、
化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接
b. 固定化植物细胞：
吸附法制备固定化植物细胞，是将植物细 胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也 可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁。用于 生产色素、香精，药物和酶等次级代谢物；



c. 固定化动物细胞： 吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。动物细胞 大多数属于附着细胞，必须依附在固体表面才能正常 生长，故可吸附在容器壁，微载体和中空纤维外壁等 载体上，制成固定化动物细胞，用于各种功能蛋白质 的生产。 中空纤维由聚丙烯，硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制 成，纤维管壁是半透膜。
在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保
持溶解状态。
• 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为
不溶态。
缺点：
(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团
被交联，酶活力损失大。
(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用
带来不便。
在没有其它载体参与，仅通过酶分子间交联 形成的固定化酶，颗粒很小，而且机械性能不佳， 为克服这一缺点，一般可先将酶吸附于载体上， 或者包埋于胶内或微囊内，然后再交联制成固定 化酶“网”膜或“网”颗粒。这种方法又称为双 重固定化法。
2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling） 借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
1）载体：亲水载体优于疏水载体 如:天然高分子衍生物: 纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 甲基丙烯醇共聚物 机械性能好，但有疏水结构 聚苯乙烯
如CM-纤维素、可先在酸等作用下转变为叠氮衍
生物，这种产物能在低温、pH7.5-8.5的情况下 和酶的氨基直接偶联。但叠氮衍生物也能和羟 基、酚羟基或巯基反应。

对含有羧甲基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载
体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物，最后与酶偶联。
⑴ 酯化 ⑵ 肼解 ⑶ 叠氮化 (4) 偶联
例如： 在进行腺三磷酶 (ATPase) 固定化时，可先用对羟
汞苯甲酸(PHMB)将酶的活性巯基保护起来，然后通过叠氮反 应将酶偶联于羧甲基纤维素上，在完成固定化以后，再用还 原剂使-SH活化，这样可得到高活性的固定化酶。
3.交联法（crosslinking）
借助双功能试剂使酶分子之间发生交
联的固定化方法。
常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜（硝酸纤维素）
与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点： 1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既 可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶 的降解，具有较大的医学价值。
缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。
包埋法是目前应用最多的一种较理想的方
海藻酸钙凝胶包埋法：
滴至 海藻酸钠溶液＋E (or cell) CaCl2 溶液中 卡拉胶包埋法： 滴至 卡拉胶＋E (or cell) 聚丙烯酰胺凝胶包埋法： Acr+ Bis+E (or cell) AP 预冷KCl 溶液中 IE (or IC) IE(or IC)
TEMED
IE (or IC)
法，与其它固定化方法相比：
•优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变
酶的高级结构，酶活回收率高。
•缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。
吸附法
共价偶联法
交联法
包埋法
酶的四种固定化方法
各种固定化方法的优缺点比较
固定化方法
吸附法
物理吸附法 离子吸附法 易 中等 易 弱
包埋法 共价结 交联法 合法
不变
强度
差
温和 琼脂、海藻酸钙、 卡拉胶、明胶
合成凝胶
聚丙烯酰胺、光 聚合反应 部分失活 高 交联树脂
制备方法：
以天然胶为载体：
先将这些天然物，溶于含水介质，然后再与酶液混和， 最后分别通过各种方法，使之胶化，制成胶包埋的球状或片 状固定化酶。 如：明胶可以添加丁醇；角叉菜胶可以添加 KCl 液，然后 冷却；海藻酸可添加氯化钙，使之以胶的形式沉淀下来。 以合成胶为载体（如聚丙烯酰胺凝胶）： 先将酶和丙烯酰胺单体分散于水介质中，然后加入聚合 促进剂和N.N’-甲叉双丙烯酰胺聚合，酶即包埋于形成的凝胶 中。
是指直径在 60-250μm ，能适用于贴壁细胞生长的微珠。
一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。
(2) 吸附法固定化细胞的应用 a. 固定化微生物细胞： 只用于生产各种能够分
泌到细胞外的产物。
酵母细胞带有负电荷，在pH 3～5的条件下 能够吸附在多孔陶瓷或多孔塑料等载体的表面， 制成固定化细胞，用于酒精和啤酒等的发酵生 产；
双功能试剂：
常用的是戊二醛 O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
利用戊二醛两个醛基 都可与酶蛋白分子的 游离氨基反应，形成 Schiff碱，从而使酶或 菌体蛋白交联，制成 固定化酶或固定化菌 体。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
交联反应既能发生在分子间，也可发生
2、微环境的影响
2、微环境的影响

分配效应：由于载体的亲水和疏水性质使 酶的底物、产物或其他效应物在微观环境 和宏观体系间发生不等分配，改变了酶反 应系统的组成平衡，从而影响了反应速度。 扩散限制效应是指底物或其他效应物的迁 移和运转受到限制Βιβλιοθήκη Baidu—种效应。
Immobilized enzyme and cell
第四章 酶与细胞的固定化
第一节 概述 第二节 固定化酶的制备 第三节 固定化酶的性质及其影响因素 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 固定化酶（细胞）的应用
第一节 概述
游离酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有 机溶剂对其有影响）。 2.酶和底物只能反应一次，难于回收利用， 不仅成本高，而且难于连续化生产。
2、包埋法：
(1) 基本概念：将细胞包埋于多孔载体内部而制成固定化 细胞的方法，称为包埋法，包埋法能保持多酶系统，是目 前制备固相细胞最常用的方法。 包埋法又分为凝胶包埋法和半透膜（胶囊）包埋法。 (2) 凝胶包埋法：以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在 凝胶的微孔内，而使细胞固定化的方法，称为凝胶包埋法。 凝胶包埋法常用载体有：琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉 菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。 (3) 半透膜胶囊包埋法：将细胞分散于有机溶剂中成乳化 液，此时，细胞被一层液态膜包围，形成具有半透膜胶囊 的固相细胞。
4. 包埋法（entrapment）
将酶用物理的方法包埋 在各种载体（高聚物）内。 分为： 网格型：将酶包埋在高分子 凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高分子 半透膜中。
1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment） 又称凝胶包埋法
使用的多孔载体及其特点
凝胶
天然凝胶
包埋条件 酶活性
固定。 一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。
2)（物理）吸附法 3)包埋法
例如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌)，是 一种胞内酶。在50--80℃加热10分钟，使菌 体自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然 保持活性，长期使用酶活力不减少。
1、吸附法
(1)
常用吸附剂：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、 多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。