第十二讲 DNA文库的构建

4.2 cDNA第一链的合成 ① oligo(dT)引导的DNA合成法 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的 特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的 oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一 链。
②随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis)
根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷 酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成 第一链cDNA的引物。
在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合 成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而 不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。
4.3 第二链cDNA的合成 • cDNA第二链的合成就是将上一步形成的 mRNA:cDNA杂合双链变成互补双链cDNA 的过程。 • cDNA第二链的合成的方法大致4种： 自身引导合成法 置换合成法 引导合成法 引物－衔接头合成法
4 基因组文库的质量标准
一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：
• 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力
• 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克 隆； • 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克 隆排序；
• 克隆片段易于从载体分子上完整卸下；
• 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。
基因组DNA文库
基因组DNA
限制性内切酶
基因重组
体外包装
转化细菌
第二节 cDNA文库构建
高等生物一般具有105种左右不同的基因， 但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有 15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同 的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克 隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得 多。
⑸噬菌体离体包装 ⑹重组噬菌体感染大肠杆菌
6 基因组文库的扩增筛选 ⑴文库的扩增 基于噬菌体载体的基因组文库通过感染大 肠杆菌，重组噬菌体在受体细胞中复制增殖并 形成噬菌斑以实现增殖。 风险：在进行文库扩增时，很难保证重组 分子均等增殖。所以造成有些克隆丢失，有的 增加，有的减少。
⑵文库的筛选 噬菌斑原位杂交 PCR文库筛选
RNase H ：特异水解与DNA 杂交的RNA上的磷酸 二酯键，产生带有3‘—OH和5’—P的产物
③引导合成法
④引物-衔接头法
5 全长cDNA文库 ( full length cDNA library
导致cDNA不完整的原因： ①cDNA第二链合成中聚合酶的外切核酸酶活性
)
② mRNA的降解，它容易从5‘端降解。起始生物材 料、抽提和纯化过程中RNase的污染、机械断裂. ③反转录酶的合成特性 与mRNA的分子结构有关 与反转录酶从转录复合体上脱离有关
①自身引导合成法
获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构的能力， 以此作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合 酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的 第二链。
②置换合成法 以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作 为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA 链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物， 在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的 第二链。
cDNA文库的构建：
mRNA
反转录酶
cDNA
基因重组
4.1 细胞总RNA的提取和mRNA的分离 RNA： tRNA、rRNA、mRNA(1%—5%）
真核生物的mRNA具有一个polyA的3’末端， 可以被用于mRNA的分离；
oligo(dT):polyA 杂交链在高盐离子浓度下可 以保持，在低盐离子浓度下或较高温度下就会 分开，利用这一性质从RNA中分离纯化mRNA。
⑵基因组DNA的片段化 ①酶切 部分酶切的主要目的是产生随机性的DNA 片段用于构建基因组文库。 ②DNA分子的物理剪切 DNA溶液的小孔喷射 超声波处理 高速搅拌
⑶载体的制备 要求： 载体的去磷酸化处理 载体的纯度
⑷重组连接 按照连接酶催化反应的最适条件设置反 应体系，同时还应通过预备性实验确立反 应体系具体的参数。
1 概念 cDNA文库： 将生物特定的组织器官或特定时期的全 部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子， 在该重组子群集中包含了其全部表达基因的 转录本。
2 cDNA文库优点 ⑴ cDNA克隆以mRNA为材料，特别适合某些病毒 基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 ⑵ cDNA文库的筛选比较简单易行。 ⑶ 每一个cDNA克隆对应一种mRNA序列，这样在 目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较 低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的， 由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因序 列。 ⑷可以在原核中表达。
基因组DNA源自文库
限制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定
基因组文库
3.2 基因组信息的可重建性 通过建立叠连群(contig)重建完整序列信 息。
3.3 文库的大小 即文库中应包含的独立重组子数。 一般来说，DNA片段长，完整基因组文 库所含的克隆数越少。反之，越多。 基因组越大，文库应包含的克隆数越多， 反之，越少。
5 基因组DNA文库构建的程序 (噬菌体基因组文库的构建) ⑴基因组DNA的分离制备 不同来源的DNA制备方法不同。 一般来说，有液相法和固相法两种。 液相法提取的DNA长度一般在100kb左右， 基本可以满足构建各种小插入片段基因组文 库的要求。
大相对分子质量(high molecular weight,HMW) 基因组DNA的提取方法
cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有 包括基因组的间隔序列，
cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着 mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆， 所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的 cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难； 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非
转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序
列的结构与功能。
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
基因组DNA文库
cDNA文库
思考题：
1 基因组DNA文库的概念及操作步骤； 2 cDNA文库的概念及操作步骤； 3 cDNA文库的优点。
基因组文库和cDNA文库的构 建
第一节
基因组文库的构建
1 基因组文库(genomielibrary):
将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后 所获得的重组子群体的总称。 作用：获得特定基因。
2 基因组文库的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒文库
噬菌体文库
黏粒文库
人工染色体文库
3 构建基因组文库应满足的条件 3.1 文库的完整性 要包含基因组的完整序列信息，通过产 生一系列一定大小、覆盖全基因组的DNA 片段的重组克隆来实现。
3 对cDNA文库质量评价 3.1文库的代表性 文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞 中表达信息的完整性。 3.2 重组cDNA片段的序列完整性。
4 cDNA文库构建的步骤 ⑴ 分离mRNA； ⑵ 富集mRNA； ⑶ cDNA的合成； ⑷ 黏性末端片段与载体的连接； ⑸ 离体包装获得重组噬菌体； ⑹ 检测重组噬菌体效价。
oligo(dG)引导合成全长dscDNA
载体引导合成全长dscDNA
置换法合成全长dscDNA
6 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 cDNA文库只包含某种生物体特定组织、特 定发育阶段表达的基因(具有时空特异性)。 基因组文库的出发材料是完整的生物基因 组DNA，每一个基因都存在于完全的基因组文 库中，并不受生物组织或发育时期的影响。