常用免疫组织化学染色方法
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常用免疫组织化学染色方法
( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)
1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)
11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)
1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法
1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.
3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
7.摔干血清，加入第一抗体，真空负压处理5分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
9.加入二抗(即连接抗体)真空负压处理5分钟。
10.PBS洗3次，每次2分钟。
11.加入链卵蛋白复合物，真空负压处理5分钟。
12.PBS洗3次，每次2分钟。
13.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
14.PBS洗，水洗。
15.染核，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
注：真空负压即将真空干燥中抽成真空。
负压达66.7KPa(500mmHg)
(四)Envision TM Systems.
1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入一抗体孵育30-60分钟。
7.PBS洗3次，每次2分钟。
8.加入增强剂孵育20-30分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(五)免疫组化双染色法。
(ⅰ) (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method)
1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入非免疫性动物血清，孵育10分钟。
7.PBS洗3次，每次2分钟。
8.加入第一抗体孵育60分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入生物素化的第二抗体，孵育10分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.加入链卵蛋白素过氧化物酶孵育10分钟。
13.PBS洗3次，每次2分钟。
14.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟。
15.PBS洗3次，每次2分钟。
16.加入双染增强液，孵育10分钟。
17.加入非免疫性动物血清孵育10分钟。
18.PBS洗3次，每次2分钟。
19.加入选用的第二种抗体孵育60分钟。
20.PBS洗3次，每次2分钟。
21.加入生物素标记的第二抗体孵育10分钟。
22.PBS洗3次，每次2 分钟。
23.加入链卵蛋白素碱性磷酸酶孵育10分钟。
24.PBS洗3次，每次2分钟。
25.加入AEC溶液，孵育5-10分钟。
26.自来水洗。
27.苏木素染核5-10分钟。
28.水性封片。
注：
1.第一种复合物也可先用链卵蛋白素碱性磷酸酶。
2.第1次显色也可用BCIP/NBT溶液，颜色为蓝黑色，但应与苏木素鉴别。
(六)、免疫组化的双染色法(ⅱ) (Immuno-histochemistry double staining method)
1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入选用的第一抗体孵育30-60分钟。
7.PBS洗3次，每次2分钟。
8.加入增强剂孵育20-30分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟
13.PBS洗3次，每次2分钟。
14.加入选用的第二种抗体孵育60分钟。
15.PBS洗3次，每次2分钟。
16.加入增强剂孵育20-30分钟。
17.PBS洗3次，每次2分钟。
18.加入酶标抗兔/鼠碱性磷酸酶复合物孵育20-30分钟。
19.PBS洗3次，每次2分钟。
20.加入AEC溶液孵育5-10分钟。
21.自来水洗。
22.苏木素染核5-10分钟。
23.水性封片。
(七)细胞培养片免疫荧光染色法。
1.将细胞于载片或盖玻片的片子用生理盐水洗几次。
2.纯丙酮固定10分钟。
3.PBS浸洗3次，每次1分钟。
4.加入选用的第一抗体孵育120分钟。
5.PBS洗3次，每次2分钟。
6.加入荧光抗体孵育60分钟以上。
7.PBS法3次，每次2分钟。
8.0.1%伊文氏蓝衬染3分钟。
9.水洗，蒸馏水洗。
10.水性胶封片或用缓冲甘油封片。
(八)真空负压免疫荧光染色法染细胞培养片。
1.将细胞爬于载玻片或盖玻片的片子用生理盐水浸洗数次，彻底洗去蛋白液。
2.纯丙酮固定5-10分钟。
3.PBS浸洗3次，每次1分钟。
4.加入选用的第一抗体孵育真空负压处理15分钟。
5.PBS洗3次，每次2分钟。
6.加入荧光抗体孵育真空负压处理15分钟。
7.PBS洗3次，每次2分钟。
8.0.1%伊文氏蓝衬染3分钟。
9.水洗，蒸馏水洗。
10.水性胶封片或用缓冲甘油封片。