卵巢癌细胞迁移侵袭探讨

卵巢癌细胞迁移侵袭探讨

1．1实验材料人卵巢透明细胞癌细胞ES-2购自上海中科院。pEGFP-

C3-4．1N质粒和pEGFP-C3质粒由美国纽约血液中心Dr．XiuliAn惠赠。McCoy＇s5A培养基购自茂健联星公司。FBS购自北京元亨金马公司。Trizol、转染试剂Li-pofectamine2000购自美国Invitrogen公司。

G418购自美国默克公司。枸橼酸抗原修复液、异丙醇、无水乙醇等购

自鼎国生物公司。免疫组化二抗及DAB显色试剂盒购自美国Dako公司。Transwell小室购自Corning公司。Matrigel胶购自美国BD公司。ＲIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、蛋白BCA定量检测试剂盒、ECL发光液均

购自普利来公司。人4．1N兔多克隆抗体由美国纽约血液中心实验室

惠赠。抗β-actin鼠单克隆抗体、HＲP标记羊抗兔(鼠)IgG二抗购自

中杉金桥公司。Vimentin、E-Cadherin、N-Cadherin、Twist、Slug抗体购自美国Epitomics公司。FastQuantＲTKit和SuperＲealPreMixPlus均购自天根生物公司。

1．2．1免疫组化选择卵巢子宫内膜异位组织标本25例和卵巢透明细

胞癌29例。切片常规脱蜡、抗原修复，3%双氧水孵育，滴加兔抗人

4．1N抗体，4℃过夜后TBS冲洗，滴加二抗，37℃孵育30min。TBS冲洗，DAB显色。苏木素复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片，光学显微镜下观察照相。4．1N免疫组化染色阳性结果为胞质内出现棕褐色颗粒或染色。切片均由2名有经验的病理科医师采用双盲法评估算分。结

果判定：采用半定量评分标准，在高倍镜下与周围间质相比，无着色

记为0分，浅褐色记为1分，褐色记为2分，深褐色记为3分;阳性细

胞百分率＜10%记1分，10%～80%记2分，＞80%记3分。两者相乘为

综合染色强度评分。0～2分为表达缺失，3～6分为表达降低，9分为

表达正常。

1．2．2细胞培养与转染人卵巢癌细胞株ES-2常规培养于含10%胎牛

血清的McCoy＇s5A培养液中，置37℃、5%CO2培养箱孵育。待贴壁生

长24h、细胞融合度约90%时胰酶消化，按1×105细胞/ml重新接种至

6孔板，培养18～24h后实行转染。采用脂质体转染试剂

Lipofectamine2000将pEGFP-C3-4．1N质粒(4．1N组)和pEGFP-C3质

粒(Con-trol组)分别转染至细胞。转染6h后，更换新培养基，37℃、5%CO2条件下，置培养箱培养。24h后加适当浓度G418筛选，7～10天后，半量G418筛选浓度维持培养，最终得到稳定转染细胞株。以Westernblot和实时荧光定量PCＲ(qＲT-PCＲ)方法检测转染效率。

1．2．3划痕实验观察细胞的迁移水平稳定转染细胞接种于6孔板，

培养约24h。用10μl枪头在6孔板底部轻划形成划痕，PBS洗去漂浮

细胞并换成无血清培养液，置37℃、5%CO2孵箱培养。0、6、24h观察拍照。用Image-J软件随机量取各图的划痕宽度3次，并计算迁移率：(0h划痕宽度－6h/24h划痕宽度)/0h划痕宽度。每组设置3个重复孔，实验重复3次。

1．2．4Transwell迁移及侵袭实验将基质胶用无血清的DMEM培养基1∶8稀释，加Transwell小室滤膜内表面，20μl/室，37℃放置1h。

将密度为5×104的细胞悬液200μl加至transwell上室，下室加

600μl完全培养基。5%CO2、37℃培养箱孵育24h后取出。PBS冲洗膜，用棉签将微孔膜上层的细胞擦去，下室用4%多聚甲醛固定10min，HE

染色，镜下随机取6个不同视野计数移至微孔膜下层的细胞。实验重

复3次。

1．2．5qＲT-PCＲ检测4．1N、Claudin4、ZO-1、Twist、Slug、ZEB-2、MMP-2和MMP-3mＲNA表达水平TＲIzol提取细胞总ＲNA，按FastQuantＲTKit说明实行逆转录合成cDNA。引物序列见表1。qＲT-PCＲ反应按SuperＲealPreMixPlus试剂盒说明配置体系并在iQ5Ｒ

eal-TimePCＲDetectionSystem上运行。结果分析采用2－ΔΔCT方法，每组实验重复3次。

1．2．6Westernblot法检测4．1N、E-cadherin、N-cadherin、Vi-mentin和Twist蛋白的表达ＲIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，计算上样体积。根据目的蛋白的分子量选择合适浓度的

凝胶实行电泳。上样于10%SDS-PAGE电泳分离后转至硝酸纤维素膜，

封闭2h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3遍，加相对应二抗，室温孵

育1h后TBST洗膜3遍，利用BioＲadimagingsystem采用ECL发光显影。

1．3统计学处理采用SPSS统计学软件。采用GraphPadprism5对数据实行绘图分析。采用Fisher精确检验，Wilcox-on秩和检验和t检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．14．1N蛋白在卵巢透明细胞癌组织中表达下调免疫组化结果显示，与异位子宫内膜相比，4．1N在卵巢透明细胞癌组织中表达显著降低(12．96%vs46．30%，P＜0．0001)，见图1。Westernblot结果显示，

转染后，4．1N组中4．1N蛋白和mＲNA水平较对照组显著增高，差异有统计学意义(P＜0．0001)。

2．24．1N负性调控卵巢透明细胞癌细胞的迁移和侵袭水平与对照组(Control)相比，4．1N组癌细胞的水平迁移水平在划痕6h及12h均明显降低(P＜0．01)，癌细胞的迁移和侵袭水平均明显受到抑制，差异

均有统计学意义(迁移细胞数：(7．88±0．58)细胞/视野

vs(16．75±1．19)细胞/视野，P＜0．0001，侵袭细胞数：

(3．50±0．50)细胞/视野vs(6．25±0．67)细胞/视野，P=0．004)。见图3、4。

2．34．1N对部分紧密连接蛋白、EMT转录因子和MMPs表达水平具有

调控作用qＲT-PCＲ结果显示，与对照组相比，4．1N组中紧密连接蛋

白Clau-din-4(P=0．0013)和ZO-1(P=0．0015)的mＲNA水平明显上调，分别是对照组的2．36±0．05倍和18．75±0．68倍，Twist、Slug、ZEB-2mＲNA、MMP-2和MMP-3mＲNA明显下调，分别是对照组

0．53±0．04、0．37±0．00、0．45±0．06、0．68±0．06和

0．71±0．11。Westernblot检测结果显示，4．1N组中Twist蛋白明

显下调，差异均有统计学意义(P＜0．05)。见图4。

3讨论