实验一 细菌感受态的制备和质粒的转化.

实验一细菌感受态的制备和质粒的转化

实验目的

通过实验学会感受态细胞的制备方法和DNA转化的最基本操作，以及如何提高转化效率的思路。本实验综合因素较多，难度较大，是分子生物学中的一个很关键的实验手段。

实验原理

转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA，而导致其原来的遗传性状发生改变，这种遗传性状包括遗传型和表型的改变。

感受态是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态。用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能够穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择性培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形成菌落。

本实验采用质粒pUC118转化大肠杆菌DH-5 ，通过氨苄青霉素抗性筛选转化子。

图1-1质粒pUC118/pUC119图谱

实验材料和试剂

（一）实验材料

大肠杆菌DH-5α

质粒pUC118（ampicillin，Amp R

（二）培养基和试剂

1. LB液体培养基(%)

胰蛋白胨（Tryptone）0.5

酵母浸出粉（Yeast extract）1.0

NaCl 0.5

pH 7.2～7.4（用2mol/L NaOH调节）

（分装：20ml/250ml三角瓶，每组2瓶。3ml/试管，每组2管。0.07Mpa 高压灭菌30分钟）。

2. LB固体培养基

LB液体培养基加入1.6%的琼脂粉即可。

（分装：50ml/250ml三角瓶，加入0.8克琼脂粉，每组1瓶。0.07Mpa 高压灭菌30分钟）。

3. 抗生素：氨苄青霉素（ampicillin,，Amp），配制成100mg/ml备用。

4. 0.1mol/L CaCl2溶液

(配制方法：称取1.1克无水CaCl2，溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml，装于250ml三角瓶中，0.07Mpa高压灭菌30分钟，4℃保存。）（三）器材

接种针10ml移液管

50ml塑料离心管5ml移液管

90mm培养皿1ml移液管

1.5ml Eppendorf管200μl吸头

三角爬15×150试管

冰块试管铝帽

牛皮纸纱布盖

线绳硫酸纸

（四）仪器

净化工作台摇床机

恒温水浴锅离心机

培养箱

实验步骤

以下均需无菌操作

（一）感受态细胞的制备

1. 大肠杆菌DH-5α冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在LB固体培养基平板上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）。

2. 从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有3ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜（约16小时）。

3. 取0.3ml菌液接种于20ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养2～3小时，待OD600值达到0.3～0.4时，取下三角瓶，立即置冰浴10～15 分钟。

4. 将细菌转移到一个灭菌的50ml离心管中，4℃3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。

5. 加入20ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀，置冰浴中30分钟。

6. 4℃3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。

7. 再加入2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心重新悬浮菌体（操作要轻）。在4℃冰箱中放置12～24小时，即可应用于DNA转化。

（二）细菌的转化

1. 取大肠杆菌DH-5α新鲜感受态细胞100μl于1.5ml Eppendorf管中，加入50～100ng质粒pUC118 DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30分钟。

2. 42℃热休克120秒，不要摇动Eppendorf管。

3. 加入LB液体培养基900μl，37℃保温60分钟。

4. 取100μl转化液涂布在含氨苄青霉素（Amp）100 μg/ml的LB固体平板上，37℃倒置培养16～24小时。

5．观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。

【提示】

实验操作中注意的问题

1. DNA与感受态细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时低，转化效率极差。

2. Eppendorf管盖紧，以免反应液溢出或外面水进入而污染。

3. 42℃热处理时很关键，转移速度要快，但温度要准确。

4. 涂布转化液时，要避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。

【思考题】

1．制备感受态细胞的关键是什么？

2．如果DNA转化后，没有得到转化子或者转化子很少，分析原因。

3．如何提高转化效率？