流感病毒裂解疫苗裂解剂去除工艺改进及稳定性研究_姚伟

总蛋白 （ μg / mL）
企业标准 7． 0 ～ 8． 0 ≤25
S201101001 7． 3
23
S201101002 7． 3
23
S201101003 7． 3
23
S201101004 7． 3
23
S201101005 7． 3
23
S201101006 7． 3
23
≤100 无 无 无 45
38． 00 43． 00
DOI:10.13309/j.cnki.pmi.2013.06.026
·12·
微生物学免疫学进展 2013 年 12 月第 41 卷第 6 期 Prog in Microbiol Immunol，Dec． 2013，Vol． 41 No． 6
·论 著·
流感病毒裂解疫苗裂解剂去除工艺改进 及稳定性研究
微生物学免疫学进展 2013 年 12 月第 41 卷第 6 期 Prog in Microbiol Immunol，Dec． 2013，Vol． 41 No． 6
毒株
A1 A3 B A1 A3 B A1 A3 B A1 A3 B A1 A3 B A1 A3 B
表 3 血凝素稳定性试验（ 37 ℃） Tab． 3 The results of HA stability test （ 37 ℃ ）
卡那霉素 （ ng / 剂）
≤20 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1
·14·
成品批号 S201101001 S201101002 S201101003 S201101004 S201101005 S201101006
成品批号 S201101001 S201101002 S201101003 S201101004 S201101005 S201101006
关键词： 流感病毒裂解疫苗； 裂解剂； 稳定性； 磷酸缓冲液（ PB）
中图分类号： Ｒ373． 1+ 3
文献标志码： A
文章编号： 1005 -5673（ 2013） 06 -0012 -05
Improvement of splitting reagent removal procedure and stability of influenza virus split vaccine
速稳定性试验、长期稳定性试验的 HA 检定结果分 别见表 3、表 4 和表 5。
表 2 工艺改进后成品中检院检定结果 Tab． 2 The test results of final product by NIFDC
成品批号
游离甲醛 硫柳汞 血凝素（ μg / mL） pH
（ μg / mL） （ μg / mL） A1 A3 B
按照诺华疫苗 （ 原浙江天元生物药业有限公 司） 流感病毒裂解疫苗制造及检定规程分别制备 A1、A3、B 型流感病毒纯化液。
将以往使用的超速区带离心除裂解剂法［1－3］改 为使用 PB 除裂解剂法［4］。向裂解后的病毒液中按
微生物学免疫学进展 2013 年 12 月第 41 卷第 6 期 Prog in Microbiol Immunol，Dec． 2013，Vol． 41 No． 6
24 ～36 24 ～36 24 ～36 29 30 26 28 33 27 27 32 27 29 33 29 28 34 28 25 32 27
≤300 111 111 110 165 178 176
卵清蛋白 （ ng / mL）
≤250 6 2 2 2 9 2
内毒素 （ Eu / mL）
≤20 合格 合格 合格 合格 合格 合格
工艺 改进后 3． 83 122． 50 40． 30
下降率 （ %） 97． 9 18． 8 78． 3
2． 2 工艺改进后 6 批疫苗的检定 经中国食品药品检定研究院检定，鉴别试验、外
观检查、装量检查、无菌检查、异常毒性试验均符合 规定，其他检定项目结果见表 2。
2． 3 工艺改进后 6 批疫苗稳定性试验 工艺改进后的 6 批疫苗，经强力稳定性试验、加
YAO Wei，JIANG Zheng-dong，LI Zhen-hui，LIU Jia-sheng （ Novartis Vaccine（ China） ，Hangzhou 311100，China）
Abstract： Objective To improve splitting reagents removal procedure for influenza virus vaccine，reduce the residual ovalbumin and splitting reagents content，improve vaccine quality and reduce costs． Method Splitting reagents in the A1， A3 and B purified influenza virus solution were removed by phosphate buffer （ PB） precipitation． Bulk was produced by sterilized by ultrafiltration of virus solution． Six batches of final bulk were prepared，including three batches with thimerosal and another three batches without thimerosal． Then a comprehensive test was proceeded to observe the stability of vaccine placed at 37 ℃ ，25 ℃ and 2 －8 ℃ for different time． Ｒesult The indicators of vaccine are consistent with " Chinese Pharmacopoeia" third （ 2010） edition requirements，including ovalbumin averaged 3． 83 ng / mL，and splitting reagents averaged 57 μg / mL，they are decreased by 97． 9% and 69% ，respectively． The vaccines are all qualified at 37 ℃ for 4 weeks，25 ℃ for 3 months or 2－8 ℃ for 12 months． Conclusion This procedure has simple steps to remove the splitting reagents and ovalbumin effectively，it is a valid procedure for improving the quality and reducing the cost of the vaccine． Key words： Influenza virus vaccine； Splitting reagents； Stability； Phosphate buffer （ PB） ．
2 结果
2． 1 流感病毒裂解疫苗工艺改进前后检定 检定结果见表 1。 从表 1 可看出，采用新工艺制备的疫苗成品卵
清蛋白、总蛋白、Triton X-100 残留量等均下降，其中 卵清蛋白残留量平均为 3． 83 ng / mL，比改进前降低 97． 9% ，远远低于国家标准。
检测项目
卵清蛋白含量（ ng / mL） 总蛋白含量（ μg / mL） Triton X-100 残留量（ μg / mL）
·13·
1 ∶ 2 加入 1 mol / L pH7． 2 PB，混合均匀后待溶液上 层出现较 多 白 色 絮 状 物 时，将 样 品 装 入 离 心 杯 中， 3 000 r / min 离 心 20 min，收 集 清 液。 经 超 滤、 0． 22 μm 孔径的滤膜过滤，即为单价原液。
共配制 6 批半成品，3 批不含硫柳汞，批号 为 S201101001、S201101002、S201101003； 3 批 含 硫 柳 汞，批 号 为 S201101004、S201101005、S201101006。 配制方法为： 用 0． 01 mol / L 的 PBS （ pH 7． 2 ） 分别 将 3 型 9 批原液稀释至血凝素（ HA） 含量为 30 μg / （ 株·mL） ，3 批含汞苗加入终质量浓度为 60 μg / mL 的硫柳汞作为防腐剂，经 0． 22 μm 孔径滤膜过 滤，即为半 成 品。 再 经 分 装、包 装、检 定 即 为 成 品。 对半成品和成品进行全面检定，并将成品送中国食 品药品检定研究院全面检定。 1． 3 稳定性试验 1． 3． 1 强力稳定性试验 将 6 批疫苗保存在（ 37 ±2） ℃ 、相对湿度（ 75 ±5） % 温箱，于 1、2、3、4 周分
性。结果 该疫苗各项指标均符合《中国药典》（ 2010 年版） 三部要求，其中卵清蛋白平均为 3． 83 ng / mL，裂解剂平
均为 57 μg / mL，比改进前分别降低 97． 9% 和 69% 。37 ℃ 放置 4 周、25 ℃ 3 个月及 2 ～ 8 ℃ 12 个月后检定全部合
格。结论 该工艺步骤简单，去除卵清蛋白和裂解剂效果明显，是进一步提高疫苗质量和降低成本的有效工艺。
收稿日期： 2013 -09 -12； 修回日期： 2013 -10 -08 基金项目： 国家科技支撑计划项目（ 2008BAI66B07） 作者简介： 姚伟（ 1959－） ，男，医学生物学高级工程师，主要从事疫苗
的临床前研究。
X-187、NIB-58，均来源于英国国家生物标准与检定 所（ National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC） 。三型毒株抗体和抗原标准品，均来源 于 NIBSC。卵清蛋白检测试剂盒，购于德国 Seramun Diagnostica GmbH 公 司，批 号 E-041a /67-06-10。磷 酸缓冲液（ 以下简称 PB） ，分析纯，浙江省湖州湖试 化学试剂有限公司生产。 1． 2 流感病毒裂解疫苗半成品制备
表 1 工艺改进前后主要检定项目比较 Tab． 1 The test results before and after improvement
欧洲药典
2010 版
标准 中国药典标准
天元 注册标准
工艺 改进前
≤2000 ≤ 690 无标准
≤500 ≤ 400 ＜300
≤250 ≤ 300 ≤ 300
181． 8 150． 9 186． 0
目前国内流感病毒裂解疫苗大多采用鸡胚生 产，所采用 的 生 产 工 艺 不 尽 相 同，质 量 指 标 差 别 较 大，尤其是可引起副反应的裂解剂残余量相对较高。 为了进一步降低裂解剂和简化裂解剂去除工艺，对 现有离心去除裂解剂生产工艺进行改进。
1 材料与方法
1． 1 试验材料 流感病 毒 毒 株 分 别 为 NYMC X-179A 、NYMC
姚伟，蒋正东，李振辉，刘家胜
（ 诺华疫苗（ 中国） ，杭州 311100）
摘要： 目的 改进流感病毒裂解疫苗裂解剂去除工艺，降低残余卵清蛋白和裂解剂含量，提高疫苗质量，降低成本。
方法 分别将 A1、A3 和 B 型流感病毒纯化液用磷酸缓冲液（ PB） 沉淀法去除裂解剂，经超滤、除菌制备原液，配制
6 批半成品，其中 3 批不含硫柳汞，3 批含硫柳汞，经全面检定，并观察放置 37 ℃ 、25 ℃ 和 2 ～ 8 ℃ 不同时间的稳定
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别取样进行 HA 含量、外观、pH 值检测，4 周增加无 菌检查和异常毒性试验。 1． 3． 2 加速稳定性试验 将 6 批疫苗保存在（ 25 ±2） ℃ 、相对湿度（ 60 ±10） % 温箱，于 1、2、3、6 个月 分别取样进行 HA 含量、外观、pH 值检测，6 个月增 加无菌检查和异常毒性试验。 1． 3． 3 长期稳定性试验 将 6 批疫苗保存在 2 ～ 8 ℃ 冷库，于 3、6、9、12 个月取样进行 HA 含量、 外观、pH 值检测。