多克隆抗体的制备方法

多克隆抗体的制备及效价测定

多克隆抗体的制备步骤

一、器材

剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。

二、试剂

生理盐水(或PBS)

弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)

弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)

二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3

三、免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。

四、兔子的选择

兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。

五、免疫

用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。

注：

抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。取血量约5ml足矣。

免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。

免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。

六、取血：

免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低，头两次取血，够检测用即可。在三次免疫后，可以获得较高效价的抗体，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否则会造成兔子贫血。

前几次取血用19号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出血清。

最后一次取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下：

1、家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢。头部略放低以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤。

2、沿颈部中线用手术刀切开皮肤约10cm，分离皮下结缔组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌(小心操作，如碰到小血管出血，可用止血钳止血)。

3、用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后用弯头眼科镊使之游离，剥离神经和结缔组织。

4、于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住。

5、用小拇指垫在血管下，用尖头眼科手术剪在两根丝线间的动脉璧上剪一小口(勿剪断)，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱。

6、松开止血钳，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血

100-120ml。

七、血清的分离

如果用三角瓶或平皿盛血，将器皿倾斜放置于37oC烘箱2hr，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用离心管收集，37oC烘箱放置2hr，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上离心，10000RCF，10分钟。在血清中加入NaN3 至终浓度0.02%，分装后-20oC保存。

效价测定

一、实验器材

仪器设备：手术剪、镊子、各个容量的量筒、各个容量的烧杯、各个容量的称量瓶、各个容量的锥形瓶、玻片、温度计、称量天枰、移液枪、酶标仪、离心机

二、实验试剂

无水乙醇、二甲苯、PBS、磷酸-柠檬酸缓冲液、0.01M枸橼酸盐缓冲液、0.05M碳酸盐缓冲液、多聚赖氨酸、花峡口蛙皮肤胰蛋白抗体、牛血清、苏木素、DAB显色液试剂盒、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体、0.05Tween-20溶液、封闭液（5%脱脂奶粉）、30%H2O2溶液、OPD显色液、TMB显色液等

三、实验方法

1、包被抗原

先配制0.05MNa2CO3-NaHCO3 缓冲液（PH9.6），然后用新鲜配制0.05MNa2CO3-NaHCO3 缓冲液稀释抗原为1：100倍浓度溶液，取出96孔酶标板，用移液枪将稀释好的抗原加到2×10孔中，每孔100ul，标记未加抗原包被的孔，置于4℃过夜。

2、洗涤

从4℃里取出已包被的酶标板，甩干包被液，每孔中加入100ul含0.05%Tween-20的PBS洗涤在3～5次，每次3～5min，最后一次洗涤后在吸水纸上拍干。

3、封闭

用移液枪向每孔中加入100ul含5%正常牛血清的PBS-T （0.05%Tween-20-PBS），置于37℃恒温培养箱中温育1h,封闭非特异性结合位点。

4、洗涤

取出已封闭的酶标板，甩干封闭液，每孔中加入100ul含0.05%Tween-20的PBS洗涤在3～5次，每次3～5min，最后一次洗涤后在吸水纸上拍干。

5、加样

将在事先准备好的兔抗血清用PBS-T从1：10进行10倍梯度稀释到1：1000000000，然后在加过包被液包被过的两排孔的第1对孔中加入免疫前兔血清为阴性对照，余下的9对孔分别按兔抗血清浓度梯度依次加入样品，每孔100ul，置于37℃恒温培养箱中温育1h。

6、洗涤

取出加过样的酶标板，甩干样品血清，每孔中加入100ul含0.05%Tween-20的PBS洗涤在3～5次，每次3～5min，最后一次洗涤后在吸水纸上拍干。

7、加酶标二抗

用PBS-T稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体至1：10000倍，每孔加入100ul，置于37℃恒温培养箱中温育1h。

8、洗涤

取出加过酶标二抗的酶标板，甩干里面的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，在每孔中加入100ul含0.05%Tween-20的PBS 洗涤在3～5次，每次3～5min，最后一次洗涤后在吸水纸上拍干。

9、加底物显色液

配制含0.03%H2O2的溶于磷酸-柠檬酸缓冲液(7ml0.1MNa2HPO4和3ml0.1M柠檬酸混合)的0.4mg/mlOPD 显色液，每孔加入新鲜配制的OPD显色液100ul，室温静置于阴暗处20～40min。

10、加终止液

待显色均匀(溶液变淡黄色)后，每孔加入50ul12%H2SO4 终止反应。

11、酶标仪读数

将加了终止液的酶标板放入酶标仪中，将波长调至490nm读