酶解大豆蛋白生产生物活性肽
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酶解大豆蛋白生产生物活性肽
游子娟 2013.3.18
酶的选择
• 动物蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋 白酶等； • 植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花 果蛋白酶等； • 微生物来源蛋白酶，如丹麦 Novo 公司生产的碱 性蛋白酶 Alcalase、复合蛋白酶 Protamex、中性 蛋白酶 Neutrase 以及国产的碱性蛋白酶地衣型芽 抱杆菌2709、中性蛋白酶枯草杆菌 1.398、放线 菌 l66、栖土曲霉 3.942、酸性蛋白酶黑曲霉 3350等。
苦味评价方法
• 称取奎啉 0.1g 溶于 50ml 5%乙醇溶液中， 从中取 5ml 溶液用蒸馏水稀释到100ml，得 到 1.0×10-4奎啉溶液，再进一步稀释成 5×10-5、2.5×10-5、1×10-5、5×10-6等浓 度奎啉溶液，其苦味值分别定为 10、5、 2.5、1、0.5,将制得的大豆多肽与不同浓度 奎啉溶液比较，从而确定大豆多肽的苦味 值。
• 步骤：在一系列的试管中加 3ml 0.05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲 液(pH8.2)，分别加入浓度 2％待测大豆肽样品溶液 100μl， 空白组加入同体积蒸馏水，再加入 100μl的 0.45mol/L 邻苯 三酚溶液，振荡并计时，待计时至三分钟时立即加入 100μl 3%抗坏血酸溶液，振荡，终止反应，在 325nm 处测吸光度 A。以抗氧化剂空白的吸光度为 A0，加抗氧化剂时吸光度为 AS，清除自由基活力 SA（scavengingactivity）可用公式表 示：
水解度的测定方法
• 大豆蛋白水解度（DH）是水解过程中所断 裂的肽键数占总肽键数的比例，通常表示 为百分数的形式。肽键断裂后生成多肽或 氨基酸，α-氨基氮含量增加，因此，水解度 可根据水解过程中生成的 α-氨基氮的数量 得到按下式进行计算： • DH（%）＝（水解后生成的 α-氨基氮的量/ 样品总含氮量）×100% • 水解后生成的 α-氨基氮的量由甲醛滴定法 测得，样品总含氮量由凯氏定氮法测得
亚油酸－硫氰酸钾方法
• 原理：通过链式反应积累起来的大量过氧 化脂质将 Fe2+氧化生成Fe3+，Fe3+和 SCN结合，生成红色硫氰酸铁。大豆肽由于能 够清除自由基，从而阻断或抑制链式反应， 减少红色硫氰酸铁产生。因此通过比色反 应可以检测大豆肽抗氧化性来自百度文库强弱。
• 在 5ml 具塞玻璃试管加入 1.5ml.0.15mol/L（pH7）的磷 酸盐缓冲液，加入浓度 2％待测大豆蛋白水解物样品 100μL，加入 100μl 50mmol/L 亚油酸的乙醇溶液和 25μl 50mmol/L 的 FeCl2-EDTA 溶液，采用漩涡分散器振荡后， 盖上玻盖，于50℃暗处水浴保温，记录保温时间。 • 大豆蛋白水解物抗氧化性检测 另取一支普通试管，加入 3ml75%乙醇，100μ l 上述混合液， 100μ l 1mol/L 的 FeCl2的 1.0mol/LHCl 溶液，100μl30%KSCN，采用漩涡 分散器振荡后，立即计时，三分钟后用蒸馏水作参比，在 480nm 处测定溶液的吸光度 A。以抗氧化剂空白的吸光 度为 A0，加抗氧化剂时吸光度为 AS，抗氧化活力 AA （antioxidative activity）可用公式表示：
蛋白酶活力的测定方法
• 酶活力的定义为：1g 固体酶粉（或 1mL 液体 酶），在一定温度和 pH 条件下，lmin内水解标 准酪蛋白产生 1μg 酪氨酸，即为 1 个酶活力单位， 以 U/g（U/mL）表示。 • 酶活测定方法为福林酚法。其原理为蛋白酶在一 定的温度与 pH 条件下，水解酪蛋白底物，产生 含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在 碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝与钨蓝， 用分光光度计于波长 680nm 下测定溶液的吸光度。 因酶活力与吸光度成正比例，由此可以计算产品 的酶活力。
大豆肽抗氧化性的研究
• 大豆蛋白酶水解物中存在具有抗氧化性的活性肽，这类活 性肽能抑制机体内自由基的大量积累，对提高自由基清除 机制起到一定功效。从而能在一定程度上消除机体内多种 生理功能的障碍，延缓机体的衰老，减少各种老年性疾病 的发生。 • 生物抗氧化剂通常通过以下五种途径来达到抗氧化目的： （1）抑制脂质过氧化反应。（2）直接清除活性氧自由基。 （3）清除氧。（4）螯合金属离子。（5）激活机体本身 内在抗氧化防御系统。五种途径实际上都是围绕阻断脂质 过氧化链式反应来进行。由于过量自由基容易引发机体内 脂质过氧化链式反应，而机体内脂质过氧化是导致组织损 伤的主要原因，所以研究抗氧化剂防止体内脂质过氧化的 能力就显得特别重要.
邻苯三酚方法
• 原理：试验通过邻苯三酚的自氧化反应产生 O2•－，研究 大豆蛋白水解物对 O2•－的清除能力。邻苯三酚的自氧化 机理比较复杂，它在碱性条件下能迅速自氧化、释放出 O2•－，生成黄色的中间产物，中间产物的累积 30～40s 后与时间成线性关系，当有抗氧化剂存在时，可清除 O2• －，从而阻止中间产物的积累，导致产物颜色较浅，采用 分光光度计对产物进行比色分析，可以检测该抗氧化剂清 除O2•－自由基的能力。
研究方法
• 1.采用亚油酸－硫氰酸钾体系、邻苯三酚自氧化体系研究 蛋白酶种类、水解方法、水解时间、水解度对水解物抗氧 化活性的影响，确定获得高抗氧化性水解物的方法。 • 2.采用 Sephadex G－25 凝胶过滤层析将大豆分离蛋白的 水解物按分子量大小分成不同部分，采用亚油酸－硫氰酸 钾体系、邻苯三酚自氧化体系和人红细胞氧化溶血实验来 研究水解液不同部分对抗氧化活性的影响。确定抗氧化性 最高的大豆肽的分子量范围。 • 3．采用高效凝胶过滤色谱对抗氧化活性较好的大豆肽段 继续进行分离，进一步确定抗氧化大豆肽的分子量分布范 围。
谢谢！
存在的问题
• 与生产大豆蛋白相比，制备大豆肽需要增加一定 量的设备和工艺程序，所以生产成本比较高，价 格也比较高，这也是多肽类制品进入市场较困难 的主要原因 。 • 其次，将大豆蛋白酶解成肽后，常常不可避免会 产生少量苦味物质，影响产品的风味 。 • 总之，随着理论和工艺条件的不断完善，大豆肽 的质量不断提高，随着脱臭 脱苦技术的不断改进， 其风味将得到很大的改善，大豆肽产品必定会被 更多的消费者认识和接受，成为人们日常生活中 的一种优质的蛋白质营养品。
一些蛋白酶的切割位点和较适 pH 值
大豆肽的性质与功能
• （l）易消化、易吸收性 • （2）低抗原性 低分子肽具有低的抗原性，不会引起过敏反应，可为食物 过敏患者食用。 （3）降胆固醇作用 大豆肽能刺激甲状腺激素分泌，促使胆固醇代谢生成胆汁 酸，胆汁酸又被食物纤维素所吸附排出体外，从而阻碍对 胆固醇吸收，起到降低胆固醇的作用。 （4）降血压作用 （5）减肥作用 （6）抗疲劳、增强体力 （7）抗氧化活性
游子娟 2013.3.18
酶的选择
• 动物蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋 白酶等； • 植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花 果蛋白酶等； • 微生物来源蛋白酶，如丹麦 Novo 公司生产的碱 性蛋白酶 Alcalase、复合蛋白酶 Protamex、中性 蛋白酶 Neutrase 以及国产的碱性蛋白酶地衣型芽 抱杆菌2709、中性蛋白酶枯草杆菌 1.398、放线 菌 l66、栖土曲霉 3.942、酸性蛋白酶黑曲霉 3350等。
苦味评价方法
• 称取奎啉 0.1g 溶于 50ml 5%乙醇溶液中， 从中取 5ml 溶液用蒸馏水稀释到100ml，得 到 1.0×10-4奎啉溶液，再进一步稀释成 5×10-5、2.5×10-5、1×10-5、5×10-6等浓 度奎啉溶液，其苦味值分别定为 10、5、 2.5、1、0.5,将制得的大豆多肽与不同浓度 奎啉溶液比较，从而确定大豆多肽的苦味 值。
• 步骤：在一系列的试管中加 3ml 0.05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲 液(pH8.2)，分别加入浓度 2％待测大豆肽样品溶液 100μl， 空白组加入同体积蒸馏水，再加入 100μl的 0.45mol/L 邻苯 三酚溶液，振荡并计时，待计时至三分钟时立即加入 100μl 3%抗坏血酸溶液，振荡，终止反应，在 325nm 处测吸光度 A。以抗氧化剂空白的吸光度为 A0，加抗氧化剂时吸光度为 AS，清除自由基活力 SA（scavengingactivity）可用公式表 示：
水解度的测定方法
• 大豆蛋白水解度（DH）是水解过程中所断 裂的肽键数占总肽键数的比例，通常表示 为百分数的形式。肽键断裂后生成多肽或 氨基酸，α-氨基氮含量增加，因此，水解度 可根据水解过程中生成的 α-氨基氮的数量 得到按下式进行计算： • DH（%）＝（水解后生成的 α-氨基氮的量/ 样品总含氮量）×100% • 水解后生成的 α-氨基氮的量由甲醛滴定法 测得，样品总含氮量由凯氏定氮法测得
亚油酸－硫氰酸钾方法
• 原理：通过链式反应积累起来的大量过氧 化脂质将 Fe2+氧化生成Fe3+，Fe3+和 SCN结合，生成红色硫氰酸铁。大豆肽由于能 够清除自由基，从而阻断或抑制链式反应， 减少红色硫氰酸铁产生。因此通过比色反 应可以检测大豆肽抗氧化性来自百度文库强弱。
• 在 5ml 具塞玻璃试管加入 1.5ml.0.15mol/L（pH7）的磷 酸盐缓冲液，加入浓度 2％待测大豆蛋白水解物样品 100μL，加入 100μl 50mmol/L 亚油酸的乙醇溶液和 25μl 50mmol/L 的 FeCl2-EDTA 溶液，采用漩涡分散器振荡后， 盖上玻盖，于50℃暗处水浴保温，记录保温时间。 • 大豆蛋白水解物抗氧化性检测 另取一支普通试管，加入 3ml75%乙醇，100μ l 上述混合液， 100μ l 1mol/L 的 FeCl2的 1.0mol/LHCl 溶液，100μl30%KSCN，采用漩涡 分散器振荡后，立即计时，三分钟后用蒸馏水作参比，在 480nm 处测定溶液的吸光度 A。以抗氧化剂空白的吸光 度为 A0，加抗氧化剂时吸光度为 AS，抗氧化活力 AA （antioxidative activity）可用公式表示：
蛋白酶活力的测定方法
• 酶活力的定义为：1g 固体酶粉（或 1mL 液体 酶），在一定温度和 pH 条件下，lmin内水解标 准酪蛋白产生 1μg 酪氨酸，即为 1 个酶活力单位， 以 U/g（U/mL）表示。 • 酶活测定方法为福林酚法。其原理为蛋白酶在一 定的温度与 pH 条件下，水解酪蛋白底物，产生 含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在 碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝与钨蓝， 用分光光度计于波长 680nm 下测定溶液的吸光度。 因酶活力与吸光度成正比例，由此可以计算产品 的酶活力。
大豆肽抗氧化性的研究
• 大豆蛋白酶水解物中存在具有抗氧化性的活性肽，这类活 性肽能抑制机体内自由基的大量积累，对提高自由基清除 机制起到一定功效。从而能在一定程度上消除机体内多种 生理功能的障碍，延缓机体的衰老，减少各种老年性疾病 的发生。 • 生物抗氧化剂通常通过以下五种途径来达到抗氧化目的： （1）抑制脂质过氧化反应。（2）直接清除活性氧自由基。 （3）清除氧。（4）螯合金属离子。（5）激活机体本身 内在抗氧化防御系统。五种途径实际上都是围绕阻断脂质 过氧化链式反应来进行。由于过量自由基容易引发机体内 脂质过氧化链式反应，而机体内脂质过氧化是导致组织损 伤的主要原因，所以研究抗氧化剂防止体内脂质过氧化的 能力就显得特别重要.
邻苯三酚方法
• 原理：试验通过邻苯三酚的自氧化反应产生 O2•－，研究 大豆蛋白水解物对 O2•－的清除能力。邻苯三酚的自氧化 机理比较复杂，它在碱性条件下能迅速自氧化、释放出 O2•－，生成黄色的中间产物，中间产物的累积 30～40s 后与时间成线性关系，当有抗氧化剂存在时，可清除 O2• －，从而阻止中间产物的积累，导致产物颜色较浅，采用 分光光度计对产物进行比色分析，可以检测该抗氧化剂清 除O2•－自由基的能力。
研究方法
• 1.采用亚油酸－硫氰酸钾体系、邻苯三酚自氧化体系研究 蛋白酶种类、水解方法、水解时间、水解度对水解物抗氧 化活性的影响，确定获得高抗氧化性水解物的方法。 • 2.采用 Sephadex G－25 凝胶过滤层析将大豆分离蛋白的 水解物按分子量大小分成不同部分，采用亚油酸－硫氰酸 钾体系、邻苯三酚自氧化体系和人红细胞氧化溶血实验来 研究水解液不同部分对抗氧化活性的影响。确定抗氧化性 最高的大豆肽的分子量范围。 • 3．采用高效凝胶过滤色谱对抗氧化活性较好的大豆肽段 继续进行分离，进一步确定抗氧化大豆肽的分子量分布范 围。
谢谢！
存在的问题
• 与生产大豆蛋白相比，制备大豆肽需要增加一定 量的设备和工艺程序，所以生产成本比较高，价 格也比较高，这也是多肽类制品进入市场较困难 的主要原因 。 • 其次，将大豆蛋白酶解成肽后，常常不可避免会 产生少量苦味物质，影响产品的风味 。 • 总之，随着理论和工艺条件的不断完善，大豆肽 的质量不断提高，随着脱臭 脱苦技术的不断改进， 其风味将得到很大的改善，大豆肽产品必定会被 更多的消费者认识和接受，成为人们日常生活中 的一种优质的蛋白质营养品。
一些蛋白酶的切割位点和较适 pH 值
大豆肽的性质与功能
• （l）易消化、易吸收性 • （2）低抗原性 低分子肽具有低的抗原性，不会引起过敏反应，可为食物 过敏患者食用。 （3）降胆固醇作用 大豆肽能刺激甲状腺激素分泌，促使胆固醇代谢生成胆汁 酸，胆汁酸又被食物纤维素所吸附排出体外，从而阻碍对 胆固醇吸收，起到降低胆固醇的作用。 （4）降血压作用 （5）减肥作用 （6）抗疲劳、增强体力 （7）抗氧化活性