血清白蛋白、γ-球蛋白的分离纯化与鉴定

血清白蛋白、γ－球蛋白的分离纯化与鉴定

1．盐析

1）取血清2.0ml加到一支15ml离心管中，加0.01M PBS液（PH7.2）2.0ml摇匀。再逐滴加入PH7.2饱和硫酸铵溶液2.0ml，边加边摇匀。静置15分钟，3000rpm离心10分钟，用滴管小心吸出上层清液置一干净一次性试管中（尽量全部吸出，但不得有沉淀物）做白蛋白脱盐之用。

2）将沉淀用1.0ml PBS液搅拌溶解，再逐滴加入饱和硫酸铵0.5ml，混匀。静置15分钟，3000rpm 离心10分钟，倾去上清液。沉淀用PBS液10滴搅拌溶解，作为γ－球蛋白脱盐之用。

2．白蛋白脱盐与纯化

脱盐

1）装柱取层析柱1支，用0.02mol/LNH4Ac湿润层析柱，剩余约1/4柱高的液柱时关闭出口。沿柱内壁缓慢灌入，用PH6.50.02mol/LNH4Ac缓冲液事先浸泡好的稀糊状葡聚糖凝胶G－25悬液约10ml，床面要平整，严防气泡，。待分层后打开出口，待液面恰与床面重合时，关闭出口。

2）加样与洗脱用细长滴管吸取白蛋白溶液，在靠近床面处沿柱内壁缓慢加入，打开出口，调节流速为6滴/分钟。待白蛋白完全进入床面后，再用0.02mol/LNH4Ac 5～10ml进行洗脱。

3）收集取小试管12支，依次编号，收集洗脱液，每管收集0.5ml（约12滴），共收集12管后，关闭出口。

4）检测准备一块干净的反应板，向每个孔中按编号顺序依次滴入收集到的洗脱液各1滴，再于各孔内依次滴入20％磺基水杨酸1滴，检测是否出现沉淀（有白色沉淀就说明白蛋白已经洗脱下来）。将出现沉淀的几管洗脱液留下，进一步做BaCl2浓度检测。于干净的反应板各孔内依次加入前一步已证明含有白蛋白的洗脱液各1滴，再对应依次加入BaCl2 1滴，检测是否出现沉淀（无白色沉淀就说明无SO42－）。

纯化

5）装柱取层析柱1支，用0.06mol/LNH4Ac湿润层析柱，剩余约1/4柱高的液柱时关闭出口。沿柱内壁缓慢灌入，事先已用0.06mol/LNH4Ac浸泡好的稀糊状DEAE悬液，床面要平整，严防气泡。待分层后打开出口，待液面恰与床面重合时，关闭出口。

6）加样与洗脱用细长滴管吸取脱盐后的白蛋白浓缩液，在靠近床面处沿柱内壁缓慢加入，打开出口，调节流速为6滴/分钟。待白蛋白完全进入床面后，再用0. 3mol/LNH4Ac液5～10ml进行洗脱。

7）收集取小试管12支，依次编号，收集洗脱液，每管收集0.5ml（约12滴），共收集12管后，关闭出口。

8）检测准备一块干净的反应板，向每个孔中按编号顺序依次滴入收集到的洗脱液各1滴，再于各孔内依次滴入20％磺基水杨酸1滴，检测是否出现沉淀（有白色沉淀就说明白球蛋白已经洗脱下来）。

9）浓缩往纯化后的白球蛋白浓度最高的那管洗脱液中加入0.1g葡聚糖G－25颗粒，摇匀后静置20分钟，待分层后做电泳鉴定。

3．γ－球蛋白脱盐与纯化

脱盐

1）装柱取层析柱1支，用PBS缓冲液湿润层析柱，剩余约1/4柱高的液柱时关闭出口。沿柱内壁缓慢灌入事先已用PBS浸泡好的稀糊状葡聚糖凝胶G－25悬液约10ml，严防气泡，床面要平整。待分层后打开出口，待液面恰与床面重合时，关闭出口。

2）加样与洗脱用细长滴管吸取γ－球蛋白溶液，在靠近床面处沿柱内壁缓慢加入，打开出口，调节流速为6滴/分钟。待γ－球蛋白完全进入床面后，再用PBS 5～10ml进行洗脱。

3）收集取小试管12支，依次编号，收集洗脱液，每管收集0.5ml（约12滴），共收集12管后，关闭出口。

4）检测准备一块干净的反应板，向每个孔中按编号顺序依次滴入收集到的洗脱液各1滴，再于各孔内依次滴入20％磺基水杨酸1滴，检测是否出现沉淀（有白色沉淀就说明γ－球蛋白已经洗脱下来）。将出现沉淀的几管洗脱液留下，进一步做BaCl2浓度检测。于干净的反应板各孔内依次加入前一步已证明含有γ－球蛋白的洗脱液各1滴，再对应依次加入BaCl2 1滴，检测是否出现沉淀（无白色沉淀就说明无SO42－）。

5）浓缩往无SO42－、γ－球蛋白浓度最高的那管洗脱液中加入0.1g葡聚糖G－25颗粒，摇匀后静置10分钟。

4．电泳鉴定

按醋酸纤维薄膜电泳的操作步骤，将γ－球蛋白、白蛋白浓缩液与血清样品同时点样电泳。将两种电泳图谱进行比较。