十用梯度平板法筛选大肠杆菌抗药性突变株

实验十用梯度平板法筛选大肠杆菌抗药性突变株

【实验目的】：了解并熟悉抗药性突变株的筛选原理和方法

【实验原理】：经诱变处理后的微生物群体中，虽然突变的数目大大增加，但所占的比例仍然是整个群体中的极少数。为了快速、准确地得到所需的突变体，必须设计一个合理的筛选方法，以杀死大量的未发生突变的野生型，而保留极少数的突变型。

梯度平板法是筛选抗药性突变型的一种有效简便方法，其操作要点是：先加入不含药物的培养基，立即吧培养皿斜放，待培养基凝固后形成一个斜面，再将培养皿平放，倒入含一定浓度药物的培养基，这样就形成一个药物浓度梯度由浓到稀的梯度培养基，然后再将大量的菌液涂布于平板表明上。经培养后，在高浓度药物处出现的菌落就是抗药性突变型菌株。【材料和器皿】：

（1）菌种：大肠埃希氏菌

（2）培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，2×（2倍浓度）牛肉膏蛋白胨培养液（分装于小三角瓶中，每瓶装20ml），生理盐水。

（3）器皿：培养皿，涂布棒，移液管，滴管，离心机

【方法和步骤】：

1 制备菌液

从已活化的斜面菌种上挑一环大肠埃希氏菌于装有5ml牛肉膏蛋白胨培养液的无菌离心管中（接2支离心管），置37℃条件下培养16h左右，离心（3500r/min，10min），弃去上清液后再生理盐水洗涤2次，弃去上清液，重新悬浮于5ml的生理盐水中。并且将2支离心管的菌液一并倒入装有玻璃珠的三角瓶中，充分振动以分散细胞，制成108/ml的菌液。然后吸3ml菌液于装有磁力搅拌棒的培养皿中。

2 紫外线照射

（1）预热紫外灯：紫外灯功率为15W，照射距离30cm。照射前先开灯预热30min。

（2）照射：将培养皿放在磁力搅拌器上，先照射1min后再打开皿盖并计时，当照射达2Min 后，立即盖上皿盖，关闭紫外灯。

3 增殖培养（在暗室红灯下操作）

照射完毕，用无菌滴管将全部菌液吸到含有3ml 2×牛肉膏蛋白胨培养液的小三角瓶中，混匀后用黑纸包裹严密，置37℃培养过夜。

4 制备梯度培养皿

取10ml 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基于直径9cm的培养皿中，立即将培养皿斜放，使高处的培养基正好位于皿边与皿底的交接处。待凝固后，将培养皿平放，在加入含有链霉素（100μg/ml）的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基10ml。待凝固后，便得到链霉素从到0逐渐递减的浓度梯度培养皿。然后在皿底做一个“↑”符号标记。

5 涂布菌液

将增殖后的菌液进行离心（3500r/min，10min），弃去上清液，再加入少量生理盐水（约0.2ml），制成浓的菌液后将全部菌液涂布于梯度培养皿上，并将它倒置于37℃恒温箱中培养24h，然后将出现于高药物浓度区内的单菌落分别接种到斜面上，经培养后再做抗药性测定。

6 抗药性测定

（1）制备含药平板：取链霉素溶液（750μg/ml）0.2、0.4、0.6、0.8ml，分别加到无菌培养皿中，再加入融化并冷却到50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基15ml，立即混匀，平置凝固后即成一个对照平板（不含药物）。

（2）抗药性的测定：将上述每个皿底的外面用记号笔画成8等分，并注明1~8号，然后将

若干抗药菌株逐个划在上述4种浓度的药物平板上和对照平板上。每一皿必须留一格接种出发菌株。然后将所有的培养皿倒置于37℃恒温箱中培养过夜。第二天观察各菌株的生长情况，并记录结果。

【结果记录】

注：以“+”表示生长，“-”表示不生长。

结果：你选到抗药菌株株，最高抗药性达μg/ml。

【注意事项】：

1 制备含药平板时，务必使药物与培养基充分混匀。

2 严格无菌操作，勿将含药平板上的杂菌误认为是抗药性大肠埃希氏菌。

【思考题】：

1 未经诱变的菌株在含药平板上是否有菌落出现？为什么？

2 你选出的抗药性菌株中，如有一支抗链霉素的菌株在含药平板上能生长，在不含药平板上反而不生长，这说明什么？