菌种的保存与复壮

（四）影响菌种存活及长期保藏的主要因素

1、培养条件和菌龄 实践证明，采用最适 培养基和最适保藏温度进行保藏，可提高微 生物的存活率，延长菌种保藏期。研究表明， 处于稳定期的细胞或成熟的孢子对不良环境 具有较强的抗性，因而，保藏非芽孢细菌和 酵母菌，应采用对数末期或稳定初期的细胞。 而保藏芽孢细菌、放线菌和霉菌，要用成熟 的孢子。


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（四）影响菌种存活及长期保藏的主要因素

3、保护剂 采用液氮超低温冷冻、真空 干燥和真空冷冻干燥保藏菌种，保护剂的选 择是提高微生物冷冻或干燥存活率，延长菌 种保藏期的关键因素。保护剂分为低分子保 护剂（低聚糖类、醇类、缓冲盐类、氨基酸 和维生素类）和大分子保护剂（蛋白质和多 肽类、多糖类）。不同微生物菌种所适宜的 保护剂不同，必须通过试验筛选而确定。

二、菌种的衰退与复壮
3、菌种衰退的防止 了解了菌种衰退的原 因，可以采取相应的措施，防止菌种的退化。 （1）控制传代次数：由于微生物存在着 自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生而 表现出来了。所以应尽量避免不必要的移种 和传代，把必要的传代降低到最低水平，以 降低自发突变的几率。菌种传代次数越多， 发生突变的几率就越高，因而菌种发生退化 的机会就越多。

二、菌种的衰退与复壮
（4）采用有效的保藏方法：对不同的菌种应有 其最适应的保藏方法，其遗传性可以相应持久。同 样的菌种保藏方法，对不同菌种来说保持其活性而 不衰退的能力和时间都不同，因此要研究不同菌种 的更有效保藏方法，以减少退化。 （5）选择合适的培养基：如培养基中适当限制 容易利用的糖源葡萄糖等的添加。因为变异多半是 通过菌株的生长繁殖而产生的，当培养基营养丰富 时，菌株会处于旺盛的生长状态，代谢水平较高， 为变异提供了良好的条件，大大提高了菌株的退化 几率。

二、菌种的衰退与复壮
（2）利用不同类型的细胞进行接种传代： 在放线菌和霉菌的菌丝细胞中常含几个核， 因此，用菌丝菌种就会出现不纯和退化，而 孢子一般是单核的，用孢子接种就没有这种 现象。 （3）创造良好的培养条件：由于培养条 件不适合可导致或加速菌种的退化，因此， 在实践中应选择不同的菌种生长的培养条件。
（四）影响菌种存活及长期保藏的主要因素

2、菌种悬液的浓度 为了保证菌种保藏 期间具有一定的存活细胞，往往将保藏微生 物的细胞浓度增大。一般要求细菌细胞和放 线菌孢子的浓度＞108／ml，酵母菌细胞和霉 菌孢子的浓度＞107／ml。液氮超低温冷冻、 真空冷冻干燥过程中，高浓度细胞可降低每 个细胞暴露在介质中的面积，从而增强了抗 冷冻和抗干燥的能力，提高了细胞的存活率。

3、干燥保藏法
（3）麸皮保藏法：又称曲法保藏，类
似于民间的大曲保藏法。将麸皮与水根 据不同菌种的要求按1:0.8或1:1或1:1.5 比例惨和，装入试管，高温灭菌后，接 入菌种和孢子液进行培养，待孢子长出 菌丝，再放入干燥器中干燥，然后置低 温下保藏，可保存1年以上。
4、寄主保藏法

又称活体保藏法。此法适用于一 些难于用常规方法保藏的动植物病 原菌和病毒。它们只能寄生在活着 的动植物或其他微生物体内，因此， 可以将此类微生物与寄主细胞混合， 低温保藏。
菌种的保存与复壮
兰州市食品药品检验所 周斌 2013.05.25
一、菌种保藏
（一）菌种保藏的目的

菌种是国家的重要自然资源，菌种 保藏是一项重要的微生物学基础工作。 菌种保藏的目的是保证菌种能够保持其 原来的生活能力，不发生变异，不被其 他杂菌污染，不死亡，以便能够很好地 研究和利用微生物。
（二）菌种保藏的原理

（四）影响菌种存活及长期保藏的主要因素
来自百度文库
6、恢复培养 处于液氮冷冻状态 的菌种恢复培养时，通常采用 38℃～40℃快速升温解冻，因为慢 速升温解冻有可能出现胞内再结冰， 造成胞内冰晶增大而伤害细胞。
二、菌种的衰退与复壮


（一）菌种的衰退 1、菌种衰退的表现 菌种衰退主要表现在以下 几个方面： （1）菌落和细胞形态的改变：微生物原有的典 型形态特性逐渐减少，变得不典型，就表现为衰退。 （2）生产性能或对寄主寄生能力的下降 （3）抗不良环境条件能力的减弱：表现在抗噬 菌体的能力，抗低温的能力，以及利用某种物质的 能力的降低等。
二、菌种的衰退与复壮
2、菌种衰退的原因 （1）基因的负突变：菌种可发生自发的 突变，其中正突变是个别的，大量的是负突 变。 （2）育种后未经很好的分离纯化：如果 未能很好的分离纯化，在经过几个代次的繁 殖后，会导致生产性状发生变化，表现为菌 种的衰退。

二、菌种的衰退与复壮
（3）不良环境的培养条件：各种微生物 都有一个适宜的环境培养条件。某个菌种若 长期生长在不适宜条件下，其优良性状很难 保持，会出现退化现象。 （4）污染杂菌：菌种被杂菌污染，或感 染了噬菌体，也是引起退化的原因。
1、低温保藏法

近年来采用一种超低温菌种保藏方法， 效果比较理想，能保存所有的微生物菌 种，使微生物的代谢处于停止状态，菌 种产生变异的可能性极小。其做法是采 取措施将菌种进行密封，然后放入– 196℃～–150℃液体氮罐中。此法可长 期保藏菌种。
2、隔绝空气保藏法
此法主要是通过限制氧的供应来减弱微生物的 代谢活动，因此不适用于厌氧菌。 （1）液体石蜡保藏法：将经过灭菌的液体石蜡 倒入培养好的菌种的斜面试管内，使石蜡油面高出 琼脂斜面末端1cm。直立试管，放入4℃冰箱内保存。 此法简便易行，保藏的时间可达1年以上。但不适 用于保藏以石蜡等为碳源的微生物。 （2）橡皮塞密封保藏法：当斜面菌种长到最好 时，用灭菌橡皮塞将原有的棉塞换掉，塞紧，用石 蜡密封，放在室温下暗处或4℃冰箱中保藏。

3、干燥保藏法
通过断绝对微生物的水分供应，使微生物的代谢活动降低。 （1）沙土管保藏法：适用于产生孢子的真菌、放线菌和 产生芽孢的细菌。将孢子或芽孢惨入到无菌的沙土管中，经 真空干燥后放入干燥器内置于4℃冰箱中，可保存1～10年。 （2）真空冷冻干燥法：真空冷冻干燥法又称冷冻干燥保 藏法，简称冻干法。此法具备了低温、真空和干燥三个保藏 菌种的条件。因此，它是目前最理想的菌种保藏方法，其保 存期可达5 ～20年，除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外， 它广泛适用于细菌、酵母菌、丝状真菌、放线菌和病毒的保 藏。其过程是先将微生物制成菌悬液，再与保护剂（脱脂牛 奶或血清等）混合，然后使其在-30℃以下迅速冻结成固体， 并抽真空使其中水分升华干燥，低温保藏。应用此法保存的 微生物存活率高，变异率低。但手续比较麻烦，需一定的设 备条件。
1、低温保藏法

低温可以抑制微生物的代谢繁殖速度，降 低突变率，是一种简单有效的保藏菌种的方 法。将菌种接种在斜面培养基上，待菌种充 分生长后用牛皮纸将斜面棉塞包好，放入4℃ 的冰箱中保藏。可保藏1～3个月，移种培养 后，可继续保藏。细菌、酵母菌、放线菌和 霉菌都可以采用这种方法保藏。此法的优点 是方法简便，易于推广，对大多数微生物都 适用。缺点是保藏期太短，菌体仍有一定的 代谢活动，容易发生变异。

二、菌种的衰退与复壮
2、通过寄主体进行复壮 对于寄生型微生物的 退化菌株，可通过接种至相应昆虫或动、植物寄主 体内以提高菌株的毒性，恢复其原来的性状。 3、淘汰已退化的个体。 以上综合了一些实践中有效的菌种复壮的方法。 但是，在进行复壮之前，还要仔细分析和判断菌种 究竟是发生了退化，还是被污染，或者是仅属一般 性的表型改变。只有对症进行复壮才能收到较好的 效果。

二、菌种的衰退与复壮
（二）菌种的复壮 1、纯种的分离 通过纯种的分离，可把退化菌 种中一部分仍保持其原有典型性状没有发生变异的 单细胞分离出来，经过扩大培养，就可恢复原菌种 的典型性状。 常用的菌种分离纯化方法很多，总体上可将它 们归纳成两类，一类较粗放，只能达到“菌落纯” 的水平，即从种的水平来说是纯的，例如琼脂平板 上划线分离法、表面涂布法或与琼脂培养基混匀后 倒平板的方法等；另一类是较精细的单细胞或单孢 子分离方法，它可以达到“细胞纯”即“菌株纯” 的水平。后一类方法种类很多，应用较广。
（四）影响菌种存活及长期保藏的主要因素 4、冻结速度 在液氮法和冻干法保藏菌 种的过程中，冻结速度是影响微生物存活率 的重要因素。研究表明。真核微生物菌种适 宜慢速冻结，而原核微生物菌种经慢速冻结 和快速冻结后，细胞存活率差异不显著。 5、保藏条件 根据菌种保藏的目的和原 理，尽量采取低温、干燥、避光和真空密封 等综合技术措施和条件保藏菌种，以利于菌 种保藏期的延长。
（三）菌种保藏的方法
各种微生物由于遗传特性不同，因此 适合采用的保藏方法也不一样。一种良 好有效的保藏方法，首先应能保持原菌 种的优良性状长期不变，同时，还须考 虑方法是通用性、操作的简便性和设备 的普及性。 常用的菌种保藏方法有低温保藏法、 隔绝空气保藏法、干燥保藏法和寄主保 藏法4大类。


微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致。菌 种保藏主要是根据微生物是生理、生化特性，创造 条件使其代谢处于不活泼的休眠状态，生长繁殖受 到抑制，从而降低菌种的变异率。从微生物本身来 讲，菌种的保藏首先要选用优良的纯种，最好是休 眠体，从环境条件来讲，主要是通过低温、干燥、 缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等手段。 使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的 休眠状态。并且尽可能多的采用不同的手段保藏一 些比较重要的微生物菌株。