第五第二章基因工程载体和工具酶
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
但在Tet中死亡
外源基因Pst I Tet中存活
但在Amp中死亡
第五第二章基因工程载体和工具酶
② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③ 高拷贝数 每个细胞可达1000~3000copy
④ 安全 失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。 不能通过接合转移。
第五第二章基因工程载体和工具酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
（6） 表达型质粒载体 主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。 注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆 的真核生物的基因置于大肠杆菌的转 录—翻译信号控制之下。
第五第二章基因工程载体和工具酶
① 表达载体的结构
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS
2）大肠杆菌操纵子元件
阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。
第五第二章基因工程载体和工具酶
大肠杆菌乳糖操纵子的调控
操纵子与操纵子模型
• 操纵子学说/操纵子模型： F.Jacob J.Mond （1960）E.coli lac operon( 1965诺贝尔医学 生理学奖)
第五第二章基因工程载体和工具酶
4. pUC系列 University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。
• “P”表示是一种质粒(plasmid)； • “BR”表示两位主要构建者姓氏的头一 个
字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”; • “322”表示实验编号。
第五第二章基因工程载体和工具酶
（1）元件来源
① 复制起点 ori pMB1系列（来源于ColE1） 的高拷贝型复制起点
② Ampr基因 pSP2124质粒的Ampr基因
正调控系统中的正调控蛋白又被称为无辅基诱导蛋白（apoinducer)
负调控系统中的负调第五控第蛋二白章基又因被工称程为载体阻和遏工蛋具酶白（repressor)
第五第二章基因工程载体和工具酶
(四)经典的大肠杆菌质粒载体 1. pSC101 第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质 粒载体。
（1）类型 天然质粒，属低拷贝型。
第五第二章基因工程载体和工具酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
（5）pBR322的优点 ① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择：
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
第五第二章基因工程载体和工具酶
外源基因BamH I Amp中存活
从pBR322上切去HaeII片断，既除 去了mob识别位点，又增加质粒的 拷贝数。
第五第二章基因工程载体和工具酶
② 改造EcoR I 位点 pBR325：使EcoRI 也成为插入失活型位点。
在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断
（带有氯霉素抗性基因cmlr）。 cmlr上也带一个EcoRI位点。
③ Tetr基因 pSC101的Tetr 基因。
第五第二章基因工程载体和工具酶
（2）长度 4361bp
（3）选择标记 氨苄青霉素和四环素抗性。
（4）克隆位点 24个克隆位点。
其中9个会导致Tetr基因失活（如 BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、 PvuI、Pst I）。
第五第二章基因工程载体和工具酶
R
PO
structural genes
＋ 正调控（positive regulation) － 负调控 (negative regulation)
DNA RNA
Protein
调控（节）蛋白
操纵子
调控蛋白的作用机制
注：R：Regulator
P：Promoter
O：Operator
第五第二章基因工程载体和工具酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
2. ColE1 （1）类型 天然质粒，属高拷贝型。 特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌 蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每 个细胞1000-3000拷贝之多！
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
•大肠杆菌素（colicin）E1 •对E1免疫的基因（immE1）
第五第二章基因工程载体和工具酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm 免疫基因
kil 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
第五第二章基因工程载体和工具酶
• 操纵子：核酸分子上调控基因转录活性的基本 单元，由结构基因、操作子（O）和启动子（P） 组成。
转录、翻译、合成蛋白
结合调节蛋白 结合RNA聚合酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
promoterΒιβλιοθήκη Baiduoperator 启动基因 操纵基因
structural genes 结构基因
操纵子(operon)模型
（4）克隆位点
EcoR I
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导
致E1失活，使受体菌不能合成E1
（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型
（ImmE1+）。
外源DNA
Colicin E1
无Colicin
第五第二章基因工程载体和工具酶
3. pBR322：
F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。
（2）长度 9.09 kb。 （3）选择标记 四环素抗性Tetr
第五第二章基因工程载体和工具酶
（4）克隆位点 6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、 BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。
（其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位 于选择标记Tetr的内部）
第五第二章基因工程载体和工具酶
（6）pBR322的缺点 •保留了转移蛋白（mob）的作用位点。 •能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别， 如果再有F质粒的参与，就有可能转移！
第五第二章基因工程载体和工具酶
（7）PBR322的改进 ① 删除mob识别位点 （如质粒pBR327、pAT153等）。 pAT153：
外源基因Pst I Tet中存活
但在Amp中死亡
第五第二章基因工程载体和工具酶
② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③ 高拷贝数 每个细胞可达1000~3000copy
④ 安全 失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。 不能通过接合转移。
第五第二章基因工程载体和工具酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
（6） 表达型质粒载体 主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。 注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆 的真核生物的基因置于大肠杆菌的转 录—翻译信号控制之下。
第五第二章基因工程载体和工具酶
① 表达载体的结构
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS
2）大肠杆菌操纵子元件
阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。
第五第二章基因工程载体和工具酶
大肠杆菌乳糖操纵子的调控
操纵子与操纵子模型
• 操纵子学说/操纵子模型： F.Jacob J.Mond （1960）E.coli lac operon( 1965诺贝尔医学 生理学奖)
第五第二章基因工程载体和工具酶
4. pUC系列 University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。
• “P”表示是一种质粒(plasmid)； • “BR”表示两位主要构建者姓氏的头一 个
字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”; • “322”表示实验编号。
第五第二章基因工程载体和工具酶
（1）元件来源
① 复制起点 ori pMB1系列（来源于ColE1） 的高拷贝型复制起点
② Ampr基因 pSP2124质粒的Ampr基因
正调控系统中的正调控蛋白又被称为无辅基诱导蛋白（apoinducer)
负调控系统中的负调第五控第蛋二白章基又因被工称程为载体阻和遏工蛋具酶白（repressor)
第五第二章基因工程载体和工具酶
(四)经典的大肠杆菌质粒载体 1. pSC101 第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质 粒载体。
（1）类型 天然质粒，属低拷贝型。
第五第二章基因工程载体和工具酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
（5）pBR322的优点 ① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择：
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
第五第二章基因工程载体和工具酶
外源基因BamH I Amp中存活
从pBR322上切去HaeII片断，既除 去了mob识别位点，又增加质粒的 拷贝数。
第五第二章基因工程载体和工具酶
② 改造EcoR I 位点 pBR325：使EcoRI 也成为插入失活型位点。
在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断
（带有氯霉素抗性基因cmlr）。 cmlr上也带一个EcoRI位点。
③ Tetr基因 pSC101的Tetr 基因。
第五第二章基因工程载体和工具酶
（2）长度 4361bp
（3）选择标记 氨苄青霉素和四环素抗性。
（4）克隆位点 24个克隆位点。
其中9个会导致Tetr基因失活（如 BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、 PvuI、Pst I）。
第五第二章基因工程载体和工具酶
R
PO
structural genes
＋ 正调控（positive regulation) － 负调控 (negative regulation)
DNA RNA
Protein
调控（节）蛋白
操纵子
调控蛋白的作用机制
注：R：Regulator
P：Promoter
O：Operator
第五第二章基因工程载体和工具酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
2. ColE1 （1）类型 天然质粒，属高拷贝型。 特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌 蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每 个细胞1000-3000拷贝之多！
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
•大肠杆菌素（colicin）E1 •对E1免疫的基因（immE1）
第五第二章基因工程载体和工具酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm 免疫基因
kil 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
第五第二章基因工程载体和工具酶
• 操纵子：核酸分子上调控基因转录活性的基本 单元，由结构基因、操作子（O）和启动子（P） 组成。
转录、翻译、合成蛋白
结合调节蛋白 结合RNA聚合酶
第五第二章基因工程载体和工具酶
promoterΒιβλιοθήκη Baiduoperator 启动基因 操纵基因
structural genes 结构基因
操纵子(operon)模型
（4）克隆位点
EcoR I
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导
致E1失活，使受体菌不能合成E1
（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型
（ImmE1+）。
外源DNA
Colicin E1
无Colicin
第五第二章基因工程载体和工具酶
3. pBR322：
F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。
（2）长度 9.09 kb。 （3）选择标记 四环素抗性Tetr
第五第二章基因工程载体和工具酶
（4）克隆位点 6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、 BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。
（其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位 于选择标记Tetr的内部）
第五第二章基因工程载体和工具酶
（6）pBR322的缺点 •保留了转移蛋白（mob）的作用位点。 •能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别， 如果再有F质粒的参与，就有可能转移！
第五第二章基因工程载体和工具酶
（7）PBR322的改进 ① 删除mob识别位点 （如质粒pBR327、pAT153等）。 pAT153：