第26章重组药物

三、纯化工艺过程的质量控制
在纯化工艺过程的质量控制上，要考虑到尽量 去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白、糖及其它 杂质，并避免在纯化过程带入的有害物质。如用柱 层析技术应提供所用填料的质量认证证明，并证实 从柱上不会掉下有害物质。上样前应清洗除去热源 等。纯化工艺的每一步均应测定纯度，计算提纯倍 数、收率等。纯化工艺过程中应尽量不加入对人体 有害的物质，若不得不加时，应设法除净，并在最 终产品中检测残余量，应远远低于有害剂量，同时 还要考虑到多次使用的积蓄作用。
3、组成工艺的各技术、步骤之间及设备间要能相 互适应和协调，且高效，收率高，易操作，对设 备条件要求低，能耗低，并尽可能少用试剂，以 免增加分离纯化步骤或干扰产品质量。
第四节 重组药物的质量控制
重组药物与其它传统方法生产的药品有许多不同 之处，它利用活细胞作为表达系统，并具有复杂的分子 结构。
它的生产涉及到生物材料和生物学过程，如：发 酵、细胞培养、分离纯化目的产物，这些过程有其固有 的易变性。同时由于重组技术所获得的蛋白质产品往往 在极微量下就可产生显著效应，任何药物性质或剂量上 的偏差，都可能贻误病情甚至造成严重危害。
第26章 重组药物
本章目录
第一节 重组药物概述 第二节 重组药物的通用制造方法与技术 第三节 重组药物的分离纯化技术关键 第四节 重组药物的质量控制 第五节 典型重组药物制造技术及工艺
第一节 重组药物概述
20世纪70年代建立的DNA重组技术带来了生物技术 新的变革，促进了以基因工程技术为核心的现代生物技术的 诞生和发展，被认为是20世纪人类的一项最伟大的贡献。
3. 分离单元之间的衔接
考虑到工业生产成本，一般 早期尽可能采用高效的分离手段， 如通常先用非特异、低分辨的操 作单元方法，以尽快缩小样品体 积，提高产物浓度，去除最主要 的杂质；然后采用高分辨率的操 作方法，而将凝胶排阻色谱这类 分离规模小、分离速度慢的操作 单元放在最后，以提高分离效果。
当几种方法连用时，最好以不同的分离机制为 基础，而且经前一种方法处理样品应能适合于作为 后一种方法的料液。
外源蛋白的复性是利用包涵体获得外源蛋白 最关键也是最复杂的一步。重组蛋白的复性操作 主要有两种方法：一种是将溶液稀释，导致变性 剂的浓度降低，促进蛋白质复性。 如果蛋白质以胞内可溶表达形式存在，则收集菌 体后破壁，离心取上清液，然后用亲和层析或离 子交换法进行纯化。在纯化过程中还常采取适当 的保护措施，如低温、加入保护剂、尽量缩短纯 化工艺及时间等措施来防止产物的降解和破坏。
如果经盐析后得到的产品，不适宜于离子交换 层析，但可直接应用于疏水层析。
离子交换、疏水及亲和色谱通常可起到蛋白质 浓缩的效应，而凝胶过滤色谱常常使样品稀释，在 离子交换色谱之后进行疏水层析色谱就很合适，不 必经过缓冲溶液的更换，因为多数蛋白质在高离子 强度下与疏水介质结合较强。
亲和层析选择性最强，但不能放在第一步，一 方面因为杂质多，易受污染，降低使用寿命；另一 方面，体积较大，需要大量的介质，而亲和层析介 质一般较贵。因此亲和层析多放在第二步以后。有 时为了防止介质中毒，在其前面加一保护柱，通常 为不带配基的介质。
干扰素的生物学活性相当广泛，主要包括广谱 抗病毒活性、直接抗肿瘤活性和免疫调节活性。
1.干扰素抗病毒作用的特点是：①不能杀死病毒， 只能抑制；②对病毒没有直接的作用，通过细胞核 内的基因产生蛋白质因子发挥作用，因此不同细胞 对干扰素的敏感不同；③病毒大量复制时引发细胞 炎症应答，此时易产生作用；④当病毒DNA已整合 到宿主细胞的染色质中时，干扰素不能发挥其抗病 毒活性。
四、对最终产品的质量控制主要包括产品的鉴 别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。
目前有许多方法可用于对重组技术所获得蛋白质 药物进行全面鉴定，如用各种电泳技术分析、高效 液相色谱分析、肽图分析、氨基酸成分分析、部分 氨基酸序列分析及免疫学分析的方法等。
对其纯度测定通常采用的方法有还原性及非还原 性SDS-PAGE、等电聚焦、各种HPLC、毛细管电泳 等，需有两种以上不同机制的分析方法相互佐证，以 便对目的蛋白质的质量进行综合评价；在其杂质控制 上要检测内毒素、热原、宿主细胞蛋白、残余DNA等。
很大，但浓度较低，因此必须在纯化前富集或浓缩，
。 可以用吸附、沉淀或超滤的方法来进行富集或浓
如果表达产物前没有信号肽序列，它可以可溶 形式或不可溶形式（包涵体）存在于细胞中。对于 胞内产物，首先要通过离心或过滤的方式收集细胞 ，并采用适当的方法破壁。在工业生产中常用大肠 杆菌作为宿主菌来生产目的蛋白，在大肠杆菌中当 外源蛋白的表达量达到20%以上时，它们一般就会 以包涵体（inclusion body）的形式存在。
一、原材料质量控制
原材料质量控制往往采用细胞学、表型鉴定、 抗生素抗性检测、限制性内切酶图谱测定、序列 分析与稳定性监控等方法。
1.需明确目的基因的来源、克隆经过，提供表 达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分 的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗 生素抗性标志物等；
2.应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检 定结果及其生物学特性等；
第三节 重组药物的分离纯化技术关键
构建好的基因工程菌在适当 条件下培养发酵，表达重组药物 后，还需选择适当的分离纯化方 法将产物提纯，制成特定的制剂， 才能被应用于临床。
而且基因工程菌培养发酵产物中含有大量的细 胞、代谢物、残留培养基、无机盐等，而目的产物 在初始物料中含量较低，同时重组药物一般都需注 射给药，对其质量、纯度要求高。为获得合格的目 的产物，必须建立与上述特点相适应的分离纯化工 艺。
由于亲和分离的选择性强，因此在产物纯化 中具有较大的潜力；疏水作用层析和反相作用层 析是利用蛋白质疏水性的作用层析通常在水溶液中 进行，蛋白在分离过程中仍保持其天然构象，而反 相作用层析是在有机相中进行，蛋白经过反相流动 相与固定相的作用有时会发生部分变性；凝胶排阻 层析根据蛋白质的相对分子质量以及蛋白质分子的 动力学体积的大小来进行分离的，它可应用于蛋白 质脱盐和蛋白质分子的分级分离。
基因工程产物常需采用层析来进行精制以达到 药用标准。在选择层析类型和条件时要综合考虑蛋 白质的性质。如蛋白质的等电点和表面电荷的分布 及目的蛋白质的稳定性。
亲和层析是一种高效的分离纯化手段，不同的 蛋白质可以选用不同的特异性亲和配基，如酶和底 物、抗原与抗体、糖链和凝集素等。
一般是目的蛋白与配基结合而杂蛋白不结合，目 的蛋白吸附后再利用快速变换洗脱液和加入竞争 剂的方法进行洗脱。
3.还需阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在 宿主细胞内的状态，如是否整合到染色体内及 在其中的拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合 后的遗传稳定性；
4.提供插入基因与表达载体两 侧端控制区内的核苷酸序列， 详细叙述在生产过程中，启动 与控制克隆基因在宿主细胞中 表达的方法及水平等。
二、培养过程的质量控制
干扰素（interferon，IFN）是机体免疫细胞产生 的一类细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细 胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功 能接近的生物调节蛋白。
根据干扰素来源及其基因序列和氨基酸组成不 同，可将干扰素分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型干扰素的表 达细胞来源类似，包括干扰素-α、β、ω、τ和λ。用 病毒等刺激外周血浆样树突细胞（pDCs）可以产生 干扰素-α、β、ω的13种亚型，3种干扰素-τ亚型和 干扰素-λ，但是没有Ⅱ型干扰素-γ。
第五节 典型重组药物制造技术及工艺
下面介绍几种临床上极为重要的重组药物如 干扰素、生长素、胰岛素等的生产技术及工艺。
5.1重组人干扰素生产技术及工艺 5.2重组人胰岛素生产技术及工艺 5.3重组人生长素生产技术及工艺 5.4重组人促红细胞生成素生产技术及工艺
5.1重组人干扰素生产技术及工艺
5.1.1 重组人干扰素概述
另外表达产物还可存在于大肠杆菌细胞周质中， 这是介于细胞内可溶性表达和分泌表达之间的一种 形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋 白类杂质，在一定程度上有利于分离纯化。大肠杆 菌经低浓度溶菌酶处理后，可采用渗透冲击的方法 来获得周质蛋白。缺点是渗透冲击的方法破壁不完 全，产物的收率较低。
2. 根据蛋白产物性质选用适宜的层析类型
在培养过程的质量控制上，要求种子克隆纯而 且稳定，在培养过程中工程菌不应出现突变或质粒 丢失现象。生产重组药物应有种子批系统，并证明 种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原 体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。 原始种子批需确证克隆基因DNA序列，详细叙述种 子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏 时宿主载体表达系统的稳定性。对菌种最高允许的
2.干扰素抗肿瘤作用：①直接抑制肿瘤细胞；② 调节宿主抗肿瘤免疫反应；③改变宿主与肿瘤细胞 的关系。
经过亲和层析后，还可能有脱落的配基存在， 而且目的蛋白质在分离和纯化过程中会聚合成二聚 体或更高的聚合物，特别是当浓度较高，或含有降 解产物时更易形成聚合体，因此最后需经过进一步 纯化操作，常使用凝胶过滤色谱，也可用高效液相 色谱法，但费用较高。
4．分离纯化工艺的要求
在重组药物分离纯化过程中，通常需要综合 使用多种分离纯化技术。另外，作为药品，其生 产必须保证安全、无菌、无热源、无污染。 1、分离纯化工艺要求有良好的稳定性和重复性， 减小原料及设备对产品的影响。 2、工艺的步骤尽可能少，时间要尽可能短，以 减少生物活性物质的破坏失活。
第二节 重组药物的通用制造方法与技术
重组药物制造的通用方法流程为： ①获得目的基因； ②将目的基因和载体连接，构建DNA重组体； ③将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌； ④工程菌的发酵； ⑤外源基因表达产物的分离纯化； ⑥产物的检验和制剂制备等。
重组药物分离纯化的一般流程为：固液分离、 细胞破碎、提取、浓缩与初步纯化、高度纯化直 至得到纯品以及成品加工等。
分离纯化重组药物须重点考虑下列几个技术因素：
1. 产物的表达形式
2. 根据蛋白产物性质选用适宜的层析类型
3. 分离单元之间的衔接
4．分离纯化工艺的要求
1. 产物的表达形式
根据外源基因表达产物在宿主细胞中的定位， 可将表达方式分为分泌型表达和胞内表达。
外源蛋白的分泌表达是通过将外源基因融合到 编码信号肽序列的下游来实现的。将外源基因接在 信号肽之后，表达产物在信号肽的引导下跨膜分泌 出胞外，同时在宿主细胞膜上存在特异的信号肽酶， 它识别并切掉信号肽，从而释放出有生物活性的外 源基因表达产物。分泌型表达产物的发酵液的体积
DNA重组技术，亦称基因重组技术，是指将DNA片段 （如基因）按人们的设计方案定向地与载体相连，并转入特 定的受体细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的 重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
应用DNA重组技术表达和生产的多肽或蛋白质类药物， 称为重组药物。
应用DNA重组技术可大量生 产过去难以获得的生理活性蛋白 和多肽，提供足够数量的生理活 性物质，以便对其生理生化及结 构等进行深入的研究和开发应用， 还可以对已有的药物进行改造， 克服其不足，创造自然界不存在 的全新物质。
在操作过程中需注意： 1、操作条件要温和，能保持目的产物的生物活性； 2、选择性要好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分 离出来，达到较高的纯化倍数； 3、收率要高； 4、两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理调 整，这样可以减少工艺步骤； 5、整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。
对其生物活性需采用国际或国家参考品，或经过 国家鉴定机构认可的参比品，以体内或细胞法测定制 品的生物学活性，并标明其活性单位；在安全性上需 按照“中国生物制品规程”进行无菌试验、热原试验、 毒性和安全试验。
由于蛋白质结构十分复杂，可能同时存在多种降 解途径，因此须在实际条件下长期观测稳定性，对产 品一致性、纯度、分子特征和生物效价等多方面的 变化情况加以综合评价，确定产品的贮藏条件和使用 期限等。