液相色谱教程(四)液相色谱柱基础知识
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阿莫西林 初始时
0
2
©2004 Waters Corporation
停流速后 (孔去湿: ~3%)
4
6
Minutes
8
10
带有极性基团的反相色谱填料
O S i
P o l a r G r o u p
C H 3 C H 3
内 嵌 极 性 基 团 配 体
O S i
C H 3 C H 3
传 统 直 链 烷 基 配 体
©2004 Waters Corporation
色谱柱选择性比较表
2.8
Waters Spherisorb® ODS1
2.3
Resolve® C18
选择性变化
(ln [a] 阿米替林/二氢苊)
1.8
µBondapak™ C18 YMC J'sphere™ ODS–L80
Waters Spherisorb® ODS2 Nucleosil® C18
Inertsil® ODS-2 Symmetry® C18
-0.2
流动相：0.1% 醋酸水溶液
阿莫西林
“湿润时”
“去湿后”
0
2
4
Vo：被分析物没有保留
©2004 Waters Corporation
6
分
8
10
SymmetryShield™ RP8： 无疏水塌陷现象发生
▪内嵌极性基团键合相： –使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定
保留时间无变化
流动相：0.1% 醋酸水溶液
低比例有机溶剂或 纯水溶液流动相
C18 硅胶
湿润的孔
未湿润的孔
பைடு நூலகம்
注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润， 那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，减少被分析物的保留 时间即等于“疏水塌陷”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！
©2004 Waters Corporation
Symmetry® C8：疏水塌陷
©2004 Waters Corporation
色谱柱品牌名称
▪不同色谱柱 “品牌名称” 表示不同的硅胶基质 –Waters Symmetry® C18 –Waters Nova-Pak® C18
▪相同的 “品牌名称” ,不同的配体表示相同的
硅胶基质，键合相不同
–Waters Symmetry® C18 –Waters Symmetry® C8
Waters 中国有限公司 培训中心
液相色谱教程 (四)
液相色谱柱基础知识
Waters 中国有限公司 培训中心
液相色谱柱基础知识 (3)
反相色谱柱的选择
液相色谱柱与分离机理的关系
▪从色谱方法上分 –正相 / 反相 –离子交换 –分子体积排除 –亲合 –疏水回受
▪从柱子类型上分 –分配 / 吸附 –离子交换 –凝胶 –亲合
Symmetry® C18 Tf USP = 1.9
0
10
20
30
分
注意：对碱性化合物而言，可以减少保留时间并且改善色谱峰形
©2004 Waters Corporation
选择性不同
▪呋喃唑酮(痢特灵)杂质分析
Symmetry® C8
0 . 0 1
SymmetryShield™ RP8
0 . 0 1
水 “屏蔽” 层
水表面层机理
H3C H
N
+
CH3
屏蔽了带负 电的硅羟基
©2004 Waters Corporation
▪降低了碱性化合物的保留 ▪降低了拖尾现象
相同硅胶基质(配体不同)
▪内置极性基团的配体与直链烷烃配体的比较
阿米替林
SymmetryShield™ RP18 Tf USP = 1.1
8
12
16
20
24
Minutes
品牌不同的影响: (相同配体)
▪注意:由于硅胶颗粒基质不同(品牌不同),分离的选择性不同
酮洛芬和痛灭定
舒洛芬
萘普生
YMC-Pack™ ODS-AQ™
舒洛芬
4
5
©2004 Waters Corporation
酮洛芬
萘普生
痛灭定
YMC-Pack™ Pro C18™
6
7
8
注意：由于硅羟基的影响，许多情况下硅胶基质对 整个键合相的性能起决定作用
©2004 Waters Corporation
配体不同的影响：C18与C4
▪提示: 相似的选择性归因于相同的硅
对羟基苯甲酸丁酯
胶基质(同一品牌,不同键合相)
萘 二氢苊
0
4
©2004 Waters Corporation
YMC-Pack™ Pro C18™ YMC-Pack™ Pro C4™
0 . 0 0 8
0 . 0 0 8
0 . 0 0 6
0 . 0 0 6
0 . 0 0 4
0 . 0 0 4
0 . 0 0 2
0 . 0 0 2
0
0
0 -. 0 0 2
- 0 . 0 0 2
0 1 0 2 0 3 0 m i n u t e s
0 1 0 2 0 3 0 m i n u t e s
注: 使用相同的流动相
©2004 Waters Corporation
内嵌极性基团配体:可能机理
▪极性基团增加了填料表层水的浓度
O
H
H
O
O-
Si
O
O O
H3C
C
C
C
(CH2)7 CH3
Si
C
O
N
O
O
Si
CH3
H
O
O
屏蔽了带负 电的硅羟基
▪降低碱性物质的保留 ▪减少了拖尾 ▪改善与水的浸润性
©2004 Waters Corporation
9
10
分
C18键合相硅胶柱填料需要 合适的湿润度
▪注意：需要有机溶剂来保证反相填料有合适的湿度,
反之停流速后易出现“疏水塌陷”问题
在1 mL/min流速下的 浸润率%
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
用于浸润固定相的甲醇水溶液的比例%
©2004 Waters Corporation
什么是“疏水塌陷”？
1.3
0.8
硅羟基活性 降低
0.3
疏水性增加
YMC J'sphere™ ODS–M80
Hypersil® ODS
YMC J'sphere™ ODS–H80 Nova-Pak® C18 YMC-Pack™ ODS–AQ™
YMC-Pack™ Pro C18™ Hypersil® BDS C18
Kromasil® C18 Inertsil® ODS-3
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对HPLC色谱柱的要求(1)
▪合适的选择性 –满足不同的分离要求
▪良好的色谱峰形 ▪重现性 ▪宽应用范围
©2004 Waters Corporation
硅胶基质C18填料都相同吗？
▪色谱实验结果揭示： –疏水性不同 –残留硅羟基活性不同
▪为什么？ –不同 C18配体键合水平（状况） ▪配体覆盖率 –不同硅胶颗粒基质 ▪密度，表面积，孔径 ▪纯度
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停流速后 (孔去湿: ~3%)
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6
Minutes
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带有极性基团的反相色谱填料
O S i
P o l a r G r o u p
C H 3 C H 3
内 嵌 极 性 基 团 配 体
O S i
C H 3 C H 3
传 统 直 链 烷 基 配 体
©2004 Waters Corporation
色谱柱选择性比较表
2.8
Waters Spherisorb® ODS1
2.3
Resolve® C18
选择性变化
(ln [a] 阿米替林/二氢苊)
1.8
µBondapak™ C18 YMC J'sphere™ ODS–L80
Waters Spherisorb® ODS2 Nucleosil® C18
Inertsil® ODS-2 Symmetry® C18
-0.2
流动相：0.1% 醋酸水溶液
阿莫西林
“湿润时”
“去湿后”
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Vo：被分析物没有保留
©2004 Waters Corporation
6
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SymmetryShield™ RP8： 无疏水塌陷现象发生
▪内嵌极性基团键合相： –使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定
保留时间无变化
流动相：0.1% 醋酸水溶液
低比例有机溶剂或 纯水溶液流动相
C18 硅胶
湿润的孔
未湿润的孔
பைடு நூலகம்
注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润， 那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，减少被分析物的保留 时间即等于“疏水塌陷”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！
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Symmetry® C8：疏水塌陷
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色谱柱品牌名称
▪不同色谱柱 “品牌名称” 表示不同的硅胶基质 –Waters Symmetry® C18 –Waters Nova-Pak® C18
▪相同的 “品牌名称” ,不同的配体表示相同的
硅胶基质，键合相不同
–Waters Symmetry® C18 –Waters Symmetry® C8
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液相色谱柱基础知识
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反相色谱柱的选择
液相色谱柱与分离机理的关系
▪从色谱方法上分 –正相 / 反相 –离子交换 –分子体积排除 –亲合 –疏水回受
▪从柱子类型上分 –分配 / 吸附 –离子交换 –凝胶 –亲合
Symmetry® C18 Tf USP = 1.9
0
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30
分
注意：对碱性化合物而言，可以减少保留时间并且改善色谱峰形
©2004 Waters Corporation
选择性不同
▪呋喃唑酮(痢特灵)杂质分析
Symmetry® C8
0 . 0 1
SymmetryShield™ RP8
0 . 0 1
水 “屏蔽” 层
水表面层机理
H3C H
N
+
CH3
屏蔽了带负 电的硅羟基
©2004 Waters Corporation
▪降低了碱性化合物的保留 ▪降低了拖尾现象
相同硅胶基质(配体不同)
▪内置极性基团的配体与直链烷烃配体的比较
阿米替林
SymmetryShield™ RP18 Tf USP = 1.1
8
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品牌不同的影响: (相同配体)
▪注意:由于硅胶颗粒基质不同(品牌不同),分离的选择性不同
酮洛芬和痛灭定
舒洛芬
萘普生
YMC-Pack™ ODS-AQ™
舒洛芬
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酮洛芬
萘普生
痛灭定
YMC-Pack™ Pro C18™
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注意：由于硅羟基的影响，许多情况下硅胶基质对 整个键合相的性能起决定作用
©2004 Waters Corporation
配体不同的影响：C18与C4
▪提示: 相似的选择性归因于相同的硅
对羟基苯甲酸丁酯
胶基质(同一品牌,不同键合相)
萘 二氢苊
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YMC-Pack™ Pro C18™ YMC-Pack™ Pro C4™
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注: 使用相同的流动相
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内嵌极性基团配体:可能机理
▪极性基团增加了填料表层水的浓度
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Si
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(CH2)7 CH3
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屏蔽了带负 电的硅羟基
▪降低碱性物质的保留 ▪减少了拖尾 ▪改善与水的浸润性
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分
C18键合相硅胶柱填料需要 合适的湿润度
▪注意：需要有机溶剂来保证反相填料有合适的湿度,
反之停流速后易出现“疏水塌陷”问题
在1 mL/min流速下的 浸润率%
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用于浸润固定相的甲醇水溶液的比例%
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什么是“疏水塌陷”？
1.3
0.8
硅羟基活性 降低
0.3
疏水性增加
YMC J'sphere™ ODS–M80
Hypersil® ODS
YMC J'sphere™ ODS–H80 Nova-Pak® C18 YMC-Pack™ ODS–AQ™
YMC-Pack™ Pro C18™ Hypersil® BDS C18
Kromasil® C18 Inertsil® ODS-3
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对HPLC色谱柱的要求(1)
▪合适的选择性 –满足不同的分离要求
▪良好的色谱峰形 ▪重现性 ▪宽应用范围
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硅胶基质C18填料都相同吗？
▪色谱实验结果揭示： –疏水性不同 –残留硅羟基活性不同
▪为什么？ –不同 C18配体键合水平（状况） ▪配体覆盖率 –不同硅胶颗粒基质 ▪密度，表面积，孔径 ▪纯度