第六章荧光分光光度法

思考题
一、概念 （荧光）激发光谱 （荧光）发射光谱
二、问答题
试述分子荧光产生的过程。 试述分子荧光强度与浓度的关系式，并
说明公式成立的前提条件及原因。 分别说明荧光分光光度计两个单色器的
作用，以及将光路设计成直角方向的原 因。 为什么可见光分光光度计的光路是直线 方向，而荧光分光光度计的光路是直角 方向？
10-6秒，磷光寿命10-3～10秒。
荧光可由激发态的分子产生，也可由激发态的 原子产生，本章介绍分子荧光。
由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光 谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可 见光区。
二、激发光谱和发射光谱
⒈ 激发光谱
固定荧光波长，以激发光波长对荧光强度(F) 所作的光谱曲线。
一般采用工作直线法。作C—F直线。 F
C
⑴配制一系列待测成分的标准溶液 C1 C2 C3 C4 C5
⑵测出相应的荧光强度
F1 F2 F3 F4 F5
⑶建立工作直线（ F →C）
①作图法
②回归法
⑷测量待测样品，得F样
①从工作直线上找到待测成分的浓度C样 ②由回归方程计算出C样
二、影响荧光强度测定的因素
【例】 苯胺
pH7～12时，发兰色荧光。 pH﹤2或PH﹥13时，无荧光。
所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当范围内。
4．溶剂 有些溶剂会使荧光效率下降，也可能带来干扰荧光。
三、定量分析的特点及应用
灵敏度高。可高达ppb级（10-9），甚至ppt 级（10-12）。
选择性好，与能产生荧光的物质少有关。
共轭双键 刚性平面 多环结构
【例】
C H2
芴具有刚性平面，产生的荧光比联二苯强。
四、荧光强度与浓度的关系
F=2.303ΦI0εbc
Φ：量子效率，发射光量子与吸收光量子之比。 I0：入射光强度 ε：摩尔吸光系数 b： 光程 c：浓度
公式成立前提条件：εbc=A<0.05
即：当试样浓度较低时（c<0.05/εb），C与F方成 线性。（如果浓度过高，分子碰撞机会增大，而产生 无辐射去激活，造成线性偏离。）
【例】硫酸奎宁（0.1mol/L硫酸溶液）的激发光谱。
F
300
350
400
λ(nm)
⒉ 发射光谱 固定激发光波长，以荧光波长对荧光强度F
所作的光谱曲线。
【例】蒽（乙醇溶液）的发射光谱。
F
300
350
400
λ(nm)
三、分子荧光与分子结构的关系
分子要产生荧光，首先要能吸收紫外光或可见光。
能产生荧光的分子具有的结构特点：
荧光分析的激发光谱和 发射光谱分别提供了哪 些定量分析信息？核黄 素的激发光谱（实线） 和发射光谱（虚线）如 图所示，对核黄素进行 荧光定量分析时，最佳 的激发光波长和荧光波 长各为多少？ 为什么？
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1．激发光照射 有一些荧光物质若受到强光照射，会发生分解而导致F↓。 所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在 测定时才打开光闸让激发光照射样品池。
2．温度 温度↑，荧光效率下降，F↓。（因为，温度↑，增加分子间 碰撞机会而使能量消耗掉。）
3．pH值
pH值能改变某些荧光物质的电子构型从而影响荧光强度。
2011
第二节 基本原理
一、分子荧光的产生
物质吸收光辐射 价电子从基态跃到激发态，然 后再回到基态 释放能量⒈以热能的形式。⒉以光辐 射的形式。以光辐射形式释放能量时，发射荧光。这 种现象称为光致发光。
激发态
无辐射跃迁
荧
磷
光
光
亚稳态（三重态）
基态
最常见的光致发光：荧光和磷光。 两者发光机理不同，寿命不同。荧光寿命10-9～
3．样品池
须用石英材料制成。
4．荧光单色器
将样品池中的散射光、反射光、杂质荧光等滤掉，只让荧 光通过。 出射狭缝宽度可调。
5．检测器
光电转换元件，测定荧光的强度。 检测方向与激发光方向垂直：在垂直方向上没有透过光的 干扰。 由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测器。
第四节 定量分析
一、定量方法
第三节 荧光分光光度计
一、基本结构示意图
样品池
光源
激发光单色器
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
荧光单色器
特点：1 ．光源方向与检测方向成直角；
2 ．二个单色器。
检测器 ·
显示器
二、主要部件及功能
1．光源
高压汞蒸气灯，氙灯。 能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度 计光源大得多。
2．激发光单色器
作用：提供单波长的激发光。 色散元件：棱镜或光栅。 出射狭缝宽度可调 。