尺寸排阻色谱法
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尺寸排阻色谱法
尺寸排阻色谱法是20世纪60年代发展起来的一种色谱分离
方法。又称为凝胶色谱法、分子排阻色潽法、凝胶过滤色 谱法、分子筛色谱法和凝胶渗透色谱法等，是液相色谱的 一种。
主要用于大分子物质如蛋白质等的分离。 固定相凝胶为化学惰性、具有多空网状结构的物质，凝胶
的每个颗粒的结构，犹如一个筛子，小的分子可以进入胶 粒内部，而大的分子则排阻于胶粒之外，从而达到分离的 目的。
3.亲脂性有机化合物的分离 可选用亲脂性凝胶，如黄酮、蒽醌、色素等分离可选用葡 聚糖凝胶LH-20。 在选用凝胶型号时，如果几种型号都可使用，根据具体情 况考虑： 从大分子蛋白质中除去氨基酸，各种型号葡聚糖凝胶均可使 用，但最好选用交联度大的G-25或G-50，因为这样易于装柱 且流速快，可缩短分离时间，如果想把氨基酸收集于一较小 体积内，并与大分子蛋白质完全分离，最好选用交联度小的 凝胶，如G-10、G-15，这样可以避免由于吸附作用而是氨基 酸扩散。由此可见，从大分子物质中除去小分子物质时，在 适宜的型号中选择交联度大的为好。反之，欲使小分子物质 浓缩并与大分子物质分离，则在适宜范围内选用交联度小的 型号为好。
1.组别分离 即从小分子物质（K=1）中分离大分子物质（K=0）或从大 分子物质中分离小分子物质，即对于分配系数有显著差别的 分离叫组别分离。如制备分离中的脱盐大多采用硬胶（G-75 型以下），既容易操作，又可得到满意的流速，常选用葡聚 糖凝胶G-25、G-50；对于小肽和低分子量物质（1000~5000） 的脱盐可采用葡聚糖凝胶G-10、G-25及聚丙烯酰胺凝胶P-2和 P-4。
三、操作方法
（一）凝胶的选择 分子排阻色潽法对所用的凝胶的基本要求： a. 化学性质惰性，不与溶质发生任何作用，可以反复使用 而不改变其色谱性质。 b. 尽可能不带电荷以防止发生离子交换作用。 c. 颗粒大小均匀，机械强度尽可能高。
除以上基本要求外，可根据分离对象和分离要求选择适当 型号的凝胶。
二、凝胶的分类
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葡聚糖凝胶的立体网状结构
商品名：Sephadex。 控制交联剂和葡聚糖的量，可以得到不同程度交联度和多 孔性的凝胶。由于分子内含有大量羟基而具有极性，在水和 其他极性溶剂如乙二醇、甲酰胺、二甲基酰胺、二甲亚砜等 中溶胀成凝胶颗粒，因醚键的不活泼性，故具有较高的稳定 性。 交联度大的孔隙小，吸液膨胀也少，可用于小分子量物质 的分离。交联度小的孔隙大，吸液膨胀也大，适用于大分子 量物质的分离。 交联度：每克干凝胶所吸收的水分重量。 商品凝胶型号多用吸水量的10倍数字来表示。如：G – 25， 表示每克干凝胶吸水量为2.5g。 注意：葡聚糖凝胶在水、盐溶液、弱酸及弱碱溶液中稳定 性较好，但长期于强酸及强氧化剂接触会破坏胶粒。微生物 可使其降解，要注意防止发霉。
2.分级分离 当被分离的物质之间分子量比较接近时，根据其分配系数的 分布和凝胶的工作范围，把某一分子量范围内的组分分离出 来，称作分级分离。分级分离的分辨率比组别分离高，但流 出曲线之间容易重叠。例如，将纤维素部分水解，然后用葡 聚糖凝胶G-25可以分离出1~6个葡萄糖单位纤维素糊精的低 聚糖，它们的分子量范围从180~990，恰在葡聚糖G-25的工 作范围（100~5000）内。 分级分离常用于分子量的测定。根据分离要求选择凝胶。这 种分离要使物质完全分离是比较困难的。
一、基本原理
(一) 分子筛效应
分子排阻色潽是根据溶质分子大小的不 同即分子筛选效应而进行分离的。 在一根长的玻璃柱中填充用适当溶剂溶 胀的凝胶颗粒，这些凝胶颗粒内部充满着 孔隙，孔隙大小不一，孔径有一定范围。 把几种分子大小不同的混合溶液加到色谱柱的顶部，然后用 溶剂进行淋洗。此时溶液中分子量大的溶质组分完全不能进 入凝胶颗粒内的孔隙中，只能经过凝胶颗粒之间的孔隙随溶 剂移动。当流完自由空间后就从柱的下端流出。
分子量小的组分，可渗入凝胶颗粒内的孔隙中。因此在流完自 由空间和全部凝胶颗粒的内空隙之后，才从柱的下端流出。 介于大小分子之间的组分，只能进入一部分颗粒内较大的孔隙， 淋洗时此组分是流过全部自由空间加上它能进入的颗粒内孔隙， 才从柱的下端流出。 在这一色谱柱的淋洗过程中，大分子的流程短，移动速度快， 先流出色谱柱；小分子的流程长，移动速度慢，后流出色柱；而 中等分子居两者之间。这种现象叫分子筛效应。 各种凝胶的空隙大小分布有一个范围。分子直径比最大空隙直 径大的这种分子就全部被排阻在凝胶颗粒以外，叫做全排除，两 种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。直径比最小孔隙 直径的分子能进入凝胶颗粒的全部孔隙，如果这样的两种或两种 以上的分子也不能达到分离效果。
谢谢！
分子排阻色谱的上样量可比其他色谱形式大些，如果是组别 分离，上样量可以是柱床体积的25%~30%；如果分离K值相 近的物质，上样量为柱床体积的2%~5%。 柱床体积：每克干凝胶溶胀以后在柱中自由沉积所成床的 体积
（三）洗脱 洗脱剂的作用原则上没有其他液相色谱要求严格，因为样 品的分离并不依赖与溶剂和样品间的相互作用力。一般要求 洗脱剂与浸泡溶胀凝胶所用的溶剂相同。因为如果换溶剂， 凝胶体积会发生变化，从而影响分离效果。除非含有较强吸 附的溶质，一般洗脱剂用量也仅需一个柱体积。完全不带电 荷的物质可用纯溶剂如蒸馏水洗脱，若分离物质有带电基团， 就需要用有一定离子强度的洗脱剂如缓冲溶液等，浓度至少 0.02M。 对吸附较强的组分也有使用水与有机溶剂的混合液，如 水 -甲醇、水 – 乙醇等，以降低吸附，将组分洗下。 洗脱液可用人工或自动收集器按一定体积分段收集，然后再 用适当的方法分析组分流出和分离情况。
（二）装柱 将所需的干凝胶浸入相当于其吸水量10倍的溶剂中，缓慢搅 拌使其分散在溶液中，防止结块，不能用机械搅拌器，避免 颗粒破碎。溶胀时间依交联度而定，交联度小的吸水量大， 需要时间长，也可加热溶胀。所制备的凝胶匀浆不宜过稀， 否则装柱时易造成大颗粒下沉，小颗粒上浮，致使填充不均 匀。 在分子排阻色谱中，影响分离度的柱参数中最重要的是柱长 度、颗粒直径及填充的均匀性。虽然理论上认为足够长的柱 可获得不同程度的分离度，柱长加倍，分离度增加40%，但 流速至少降低50%，在分子排阻色谱中原来就存在着分离速 度慢的缺点，因此很少使用长于100cm的柱。当分离K值较接 近组分时，柱长却需要超过100cm时，可采用几根短柱串联。 装柱填充时不应有气泡，填充后用同一种洗脱剂以2~3倍总 体积使柱平衡。填充均匀与否可以用0.2%蓝色葡聚糖（分子 量2000，溶于同一洗脱剂中）溶液经过柱床，观察其在柱内 移动情况来判断。
尺寸排阻色谱法是20世纪60年代发展起来的一种色谱分离
方法。又称为凝胶色谱法、分子排阻色潽法、凝胶过滤色 谱法、分子筛色谱法和凝胶渗透色谱法等，是液相色谱的 一种。
主要用于大分子物质如蛋白质等的分离。 固定相凝胶为化学惰性、具有多空网状结构的物质，凝胶
的每个颗粒的结构，犹如一个筛子，小的分子可以进入胶 粒内部，而大的分子则排阻于胶粒之外，从而达到分离的 目的。
3.亲脂性有机化合物的分离 可选用亲脂性凝胶，如黄酮、蒽醌、色素等分离可选用葡 聚糖凝胶LH-20。 在选用凝胶型号时，如果几种型号都可使用，根据具体情 况考虑： 从大分子蛋白质中除去氨基酸，各种型号葡聚糖凝胶均可使 用，但最好选用交联度大的G-25或G-50，因为这样易于装柱 且流速快，可缩短分离时间，如果想把氨基酸收集于一较小 体积内，并与大分子蛋白质完全分离，最好选用交联度小的 凝胶，如G-10、G-15，这样可以避免由于吸附作用而是氨基 酸扩散。由此可见，从大分子物质中除去小分子物质时，在 适宜的型号中选择交联度大的为好。反之，欲使小分子物质 浓缩并与大分子物质分离，则在适宜范围内选用交联度小的 型号为好。
1.组别分离 即从小分子物质（K=1）中分离大分子物质（K=0）或从大 分子物质中分离小分子物质，即对于分配系数有显著差别的 分离叫组别分离。如制备分离中的脱盐大多采用硬胶（G-75 型以下），既容易操作，又可得到满意的流速，常选用葡聚 糖凝胶G-25、G-50；对于小肽和低分子量物质（1000~5000） 的脱盐可采用葡聚糖凝胶G-10、G-25及聚丙烯酰胺凝胶P-2和 P-4。
三、操作方法
（一）凝胶的选择 分子排阻色潽法对所用的凝胶的基本要求： a. 化学性质惰性，不与溶质发生任何作用，可以反复使用 而不改变其色谱性质。 b. 尽可能不带电荷以防止发生离子交换作用。 c. 颗粒大小均匀，机械强度尽可能高。
除以上基本要求外，可根据分离对象和分离要求选择适当 型号的凝胶。
二、凝胶的分类
wk.baidu.com
葡聚糖凝胶的立体网状结构
商品名：Sephadex。 控制交联剂和葡聚糖的量，可以得到不同程度交联度和多 孔性的凝胶。由于分子内含有大量羟基而具有极性，在水和 其他极性溶剂如乙二醇、甲酰胺、二甲基酰胺、二甲亚砜等 中溶胀成凝胶颗粒，因醚键的不活泼性，故具有较高的稳定 性。 交联度大的孔隙小，吸液膨胀也少，可用于小分子量物质 的分离。交联度小的孔隙大，吸液膨胀也大，适用于大分子 量物质的分离。 交联度：每克干凝胶所吸收的水分重量。 商品凝胶型号多用吸水量的10倍数字来表示。如：G – 25， 表示每克干凝胶吸水量为2.5g。 注意：葡聚糖凝胶在水、盐溶液、弱酸及弱碱溶液中稳定 性较好，但长期于强酸及强氧化剂接触会破坏胶粒。微生物 可使其降解，要注意防止发霉。
2.分级分离 当被分离的物质之间分子量比较接近时，根据其分配系数的 分布和凝胶的工作范围，把某一分子量范围内的组分分离出 来，称作分级分离。分级分离的分辨率比组别分离高，但流 出曲线之间容易重叠。例如，将纤维素部分水解，然后用葡 聚糖凝胶G-25可以分离出1~6个葡萄糖单位纤维素糊精的低 聚糖，它们的分子量范围从180~990，恰在葡聚糖G-25的工 作范围（100~5000）内。 分级分离常用于分子量的测定。根据分离要求选择凝胶。这 种分离要使物质完全分离是比较困难的。
一、基本原理
(一) 分子筛效应
分子排阻色潽是根据溶质分子大小的不 同即分子筛选效应而进行分离的。 在一根长的玻璃柱中填充用适当溶剂溶 胀的凝胶颗粒，这些凝胶颗粒内部充满着 孔隙，孔隙大小不一，孔径有一定范围。 把几种分子大小不同的混合溶液加到色谱柱的顶部，然后用 溶剂进行淋洗。此时溶液中分子量大的溶质组分完全不能进 入凝胶颗粒内的孔隙中，只能经过凝胶颗粒之间的孔隙随溶 剂移动。当流完自由空间后就从柱的下端流出。
分子量小的组分，可渗入凝胶颗粒内的孔隙中。因此在流完自 由空间和全部凝胶颗粒的内空隙之后，才从柱的下端流出。 介于大小分子之间的组分，只能进入一部分颗粒内较大的孔隙， 淋洗时此组分是流过全部自由空间加上它能进入的颗粒内孔隙， 才从柱的下端流出。 在这一色谱柱的淋洗过程中，大分子的流程短，移动速度快， 先流出色谱柱；小分子的流程长，移动速度慢，后流出色柱；而 中等分子居两者之间。这种现象叫分子筛效应。 各种凝胶的空隙大小分布有一个范围。分子直径比最大空隙直 径大的这种分子就全部被排阻在凝胶颗粒以外，叫做全排除，两 种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。直径比最小孔隙 直径的分子能进入凝胶颗粒的全部孔隙，如果这样的两种或两种 以上的分子也不能达到分离效果。
谢谢！
分子排阻色谱的上样量可比其他色谱形式大些，如果是组别 分离，上样量可以是柱床体积的25%~30%；如果分离K值相 近的物质，上样量为柱床体积的2%~5%。 柱床体积：每克干凝胶溶胀以后在柱中自由沉积所成床的 体积
（三）洗脱 洗脱剂的作用原则上没有其他液相色谱要求严格，因为样 品的分离并不依赖与溶剂和样品间的相互作用力。一般要求 洗脱剂与浸泡溶胀凝胶所用的溶剂相同。因为如果换溶剂， 凝胶体积会发生变化，从而影响分离效果。除非含有较强吸 附的溶质，一般洗脱剂用量也仅需一个柱体积。完全不带电 荷的物质可用纯溶剂如蒸馏水洗脱，若分离物质有带电基团， 就需要用有一定离子强度的洗脱剂如缓冲溶液等，浓度至少 0.02M。 对吸附较强的组分也有使用水与有机溶剂的混合液，如 水 -甲醇、水 – 乙醇等，以降低吸附，将组分洗下。 洗脱液可用人工或自动收集器按一定体积分段收集，然后再 用适当的方法分析组分流出和分离情况。
（二）装柱 将所需的干凝胶浸入相当于其吸水量10倍的溶剂中，缓慢搅 拌使其分散在溶液中，防止结块，不能用机械搅拌器，避免 颗粒破碎。溶胀时间依交联度而定，交联度小的吸水量大， 需要时间长，也可加热溶胀。所制备的凝胶匀浆不宜过稀， 否则装柱时易造成大颗粒下沉，小颗粒上浮，致使填充不均 匀。 在分子排阻色谱中，影响分离度的柱参数中最重要的是柱长 度、颗粒直径及填充的均匀性。虽然理论上认为足够长的柱 可获得不同程度的分离度，柱长加倍，分离度增加40%，但 流速至少降低50%，在分子排阻色谱中原来就存在着分离速 度慢的缺点，因此很少使用长于100cm的柱。当分离K值较接 近组分时，柱长却需要超过100cm时，可采用几根短柱串联。 装柱填充时不应有气泡，填充后用同一种洗脱剂以2~3倍总 体积使柱平衡。填充均匀与否可以用0.2%蓝色葡聚糖（分子 量2000，溶于同一洗脱剂中）溶液经过柱床，观察其在柱内 移动情况来判断。