浅析秀丽隐杆线虫被大量用于筛选抗衰老药物的原因和相关实验步骤

浅析秀丽隐杆线虫被大量用于筛选抗衰老药物的原因和相关实验步骤
作者：彭宇昀
来源：《健康前沿》2019年第04期
摘要：秀丽隐杆线虫是研究老化现象的重要模型生物，已经使用了近40年，在对具有延缓衰老作用的相關药物进行初步筛选方面具有重大贡献。

本文通过对有关文献和实验进行分析，就秀丽隐杆线虫被大量应用于筛选抗衰老化合物的原因和有关实验展开研究，分析利用秀丽隐杆线虫进行抗衰老药物筛选的优点，总结相关实验步骤，得出秀丽隐杆线虫细胞数目固定，与人类基因同源性较高且易养殖是其用于进行药物筛选的重要原因。

总结出进行实验时需要充分考虑，排除如待测的相关药物对OP50菌液的抑制性等无关变量对实验结果的影响。

关键词：秀丽隐杆线虫，抗衰老，筛选，原因
秀丽隐杆线虫作为模式生物在生命科学的各项研究中使用广泛，大量运用于抗衰老药物的筛选。

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近年来，有研究提出诸如阿司匹林，二甲双胍等常用药物成分具有延缓人体衰老的功能，而秀丽隐杆线虫在对这类化合物的筛选过程中起了重要作用。

本文将探究秀丽隐杆线虫被广泛应用于抗衰老化合物筛选的原因。

1 原因分析
1.1自身原因
1.1.1 细胞数量固定
经研究发现，秀丽隐杆线虫在其幼虫时期有556个体细胞和2个原始生殖细胞。

秀丽隐杆线虫的成虫可分为：雄性个体和雌雄同体个体两类，其中雄性成熟个体有1031个体细胞和1000个生殖细胞，雌雄同体成熟个体含有959个体细胞和2000个生殖细胞。

固定的细胞数量使研究人员可以更容易对比不同化合物的作用下，同种细胞在不同个体中在药物作用下的具体变化，减少无关变量的产生，使不同个体（如：用抗衰老药物处理和不用抗衰老药物处理的个体）的同种细胞之间差异性的比较更具有说服力。

同时，可以更好的探究药物在具体细胞中的作用方式、具体效果，探究对应化合物具有抗衰老作用的原因。

1.1.2 生殖能力强，雌雄同体
相关文献表明，当秀丽隐杆线虫的雌雄同体成熟个体自体受精时可产生200～300颗卵，而雄性成熟个体与雌雄同体成熟个体交配，发生异体受精时可以产生1000多颗卵。

同时，受精过的卵孵化速度快，时间短，在25℃的条件下只需大约20个小时就可以孵化成L1期的幼虫，秀丽隐杆线虫的受精卵从发育到性成熟只需3天的时间。

强大的生殖能力和其雌雄同体的特性保证了实验材料的充足，和另两种模式生物：果蝇（Drosophila melanogaster）与小鼠相同。

，强大的生殖能力是他们能被选作模式生物的重要原因之一，因而现在被广泛的用于各种科学研究。

1.1.3 属于自由生活线虫，对人体、环境无毒害作用
秀丽隐杆线虫与大多数的线虫不同，它是自由生活种类线虫，不需要寄生在动植物中生存。

土壤中就有秀丽隐杆线虫的存在，其对环境没有毒害作用。

同时，作为模式生物，秀丽隐杆线虫已被证实对人体无害，因而可以在实验室大量培养，用于各种实验。

1.1.4 个体微小，通体透明，易观察
秀丽隐杆线虫成虫长约1.5mm，通体透明，可用体式显微镜直接进行观察。

通体透明使雌雄同体成虫体内的卵可被直接观察到，为区分成虫提供了有利条件，跟容易进行同步化。

易于观察的特点使研究人员可以更容易的判断其运动性强弱，咽泵运动是否存在，同时也可以通过多次触碰的方式来判断秀丽隐杆线虫是否死亡，对后续最长寿命、半数致死天数的统计和分析提供了有利条件
1.1.5 生命周期短
在20℃的条件下，秀丽隐杆线虫在实验室中的生命周期一般为2～3周，发育期只有几天。

较短的生命周期使筛选具有抗衰老作用的化合物的实验周期大幅缩短，筛选效率大幅提升。

1.1.7基因特点
秀丽隐杆线虫的所有基因组已经完成了测序，其所有基因组可以直接在网络上查到，而且其药靶基因中有60%～80%与人类基因同源。

而在孟德尔人类遗传资料库的人类疾病基因中，秀丽隐杆线虫也有20%以上与人类同源。

在抗衰老化合物的筛选过程中，由于待测化合物数量多不同模式生物进行相关测试所需的时间和物质成本相差较大，一般来说与人同源性越高的模式生物进行抗衰老实验所需的时间和物质成本也就越高。

所以筛选过程按与人类基因同源性由小到大，所用时间和物质成本由低到高进行分层筛选，一般按照酵母菌，秀丽隐杆线虫，果蝇，小鼠的顺序进行筛选。

由于其药靶基因与人类的同源性较高，进行抗衰老药物筛选具有一定的参考价值，Petrascheck就用秀丽隐杆线虫筛选了8.8万个化合物，并发现其中有115个可以延长秀丽隐杆线虫的寿命，其较强的筛选能力也是其被广泛使用的原因之一。

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1.2外围因素
1.2.1 易养殖
秀丽隐杆线虫以细菌为食，可以用另一种模式生物大肠杆菌在培养基中进行培养。

一般实验室用OP50—NGM培养基进行培养，尿嘧啶缺陷型大肠杆菌只能从NGM中获取尿嘧啶才可以生长，所以其生长速度远低于一般大肠杆菌，它既可以为秀丽隐杆线虫提供充足的食物，又不会因为生长过快而制约秀丽隐杆线虫的生长。

而对应的尿嘧啶缺陷型大肠杆菌只需利用L Broth液体培养基培养就可大量制得，培养方法的简单和秀丽隐杆线虫强大的繁殖能力，为筛选化合物所需的大量线虫提供了供应保障。

1.2.2 同步化过程简单，得到的同步化线虫数量多
同步化的线虫可以直观的通过对比，比较出药物对其寿命的影响。

同步化秀丽隐杆线虫的方法并不复杂，用健康成虫、M9缓冲液、线虫裂解液（次氯酸钠和氢氧化钠混合溶液），经洗脱、裂解、离心等步骤后，即可得到大量同步化虫卵。

区分成虫时只需利用显微镜对虫体进行观察，若发现虫体中有卵即为雌雄同体秀丽隐杆线虫成虫
2 相关试验方法
根据大量有关文献和对上述原因分析，总结了相关实验方法。

2.1 培养方式
秀丽隐杆线虫可以用固体培养基或液体培养基进行培养，同时需要制备大肠杆菌OP50相关溶液、M9缓冲液和消化液。

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固体培养基需用NGM培养基和1M磷酸缓冲液，液体培养基需S medium、S 培養原液、1M 柠檬酸钾和相关金属溶液。

2.2 检测药物对OP50菌液的影响
由于秀丽隐杆线虫需要以大肠杆菌为食，若被检测的相关药物具有抗菌作用，则需要在实验前进行检测，以防止相关药物减少秀丽隐杆线虫的摄食量，导致秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）进入持久期，发挥秀丽隐杆线虫自身的抗衰老作用。

检测药物对OP50菌液的影响可通过设置对照实验进行，检测加入了相关药物后OP50培养基的OD值和不加入相关药物的对照组OP50培养基的OD值并进行比较。

若在细菌的对数生长期中OD值没有统计学上的差异，则相关药物对OP50生长无显著影响。

2.3 检测秀丽隐杆线虫对相关药物是否有饮食偏好
对于像大多数中药一样具有特殊气味的药物，需要先分析相关药物的特殊气味是否会对秀丽隐杆线虫的饮食偏好有所影响。

判断秀丽隐杆线虫对相关药物是否有饮食偏好可通过设置吸引实验，检测并统计含有相关药物的菌斑和对照组不含相关药物的菌斑吸引的秀丽隐杆线虫的数目有无统计学差异来得出有关结论。

2.4 抗衰老相关指标检测
秀丽隐杆线虫的生命周期可分为四个阶段，生殖期、壮年期、衰老期和老年期。

上述四个时期可分别通过检测秀丽隐杆线虫的自体受精、快速身体运动、咽部运动的结束和死亡四个阶段进行区分。

2.4.1 自体受精
观测自体受精可以每天将秀丽隐杆线虫幼虫进行转移，每次转移到新的NGM培养基中并观测培养基中是否有新的幼虫出现，直至不再出现新的幼虫，届时可判断秀丽隐杆线虫已进入壮年期。

每天将秀丽隐杆线虫进行转移既是为了检测其是否处在生殖期，又是防止其与其子代幼虫被混淆的关键措施，必须要及时进行。

2.4.2 身体运动
观测秀丽隐杆线虫的身体运动可通过敲击培养皿，观察秀丽隐杆线虫在10sec内头部运动距离是否大于1mm，若大于则秀丽隐杆线虫处在快速运动期；若小于则处在非快速运动期。

2.4.3 咽部运动
观测咽部运动时，需在显微镜下记录10sec内秀丽隐杆线虫咽部的收缩次数，多次测量取平均值。

收缩次数在1～24次为缓慢收缩，大于等于24次为快速收缩，0次为不收缩。

2.5 细化实验，探究相关药物对秀丽隐杆线虫的抗衰老作用所处阶段
在检测出相关药物对秀丽隐杆线虫具有抗衰老作用后，可进一步细化实验以探究相关药物的具体作用时期。

由于秀丽隐杆线虫的生命周期分为四个阶段，细化实验时可通过上文叙述的判断方法区分秀丽隐杆线虫所处的阶段，具体统计每一阶段所处的天数并与对照组进行对比。

3结论
1、由上述文章分析可知，秀丽隐杆线虫广泛用于药物筛查的原因主要是秀丽隐杆线虫固定的细胞数目，基因与人类同源性较高且易养殖。

固定的细胞数目有助于减少无关变量，使实验结果更具说服力；由于基因与人类同源性越高的动物往往越难养殖，所以秀丽隐杆线虫与人类在基因上较高的同源性和其易养殖的特点让其被广泛运用于抗衰老药物的初步筛查。

2、实验时需充分考虑被筛选药物在无关变量方面对实验结果的影响。

实验中除了要减少常规物理因素带来的无关变量对实验结果的影响之外，还要注意药物是否会对培养基，秀丽隐杆线虫的进食行为产生非药理性影响。

参考文献：
[1]杨再昌，杨小生.秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）在药物筛选中的应用[J].生命科学，2009，21（04）：593-598.
[2]Petrascheck M，Ye XL，Buck LB. An antidepressant thatextends lifespan in adult Caenorhabditis elegans. Nature，2007，450（11）：553-6
[3]刘静. 黄芪多糖对秀丽隐杆线虫的延寿作用及其机制研究[D]. 哈尔滨医药大学，2013.。