液相色谱法分离手性药物
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衍生物）； 手性离子对配合剂(Chiral Ion Pair Complex,CIPC)，如（+） -10-樟脑磺酸、奎宁和奎尼丁等； 配位体交换型手性流动相添加剂（Chiral Ligand-exchange Complexs, CLEC) 。
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手性固定相（CSP）法
手性固定相（CSP）法
优点是： 优点是： 能广泛适用于各类化合物，适于常规及生物样品的分析测定；； ★能广泛适用于各类化合物，适于常规及生物样品的分析测定；； 除非必须衍生化，否则无需高光学纯度试剂； ★除非必须衍生化，否则无需高光学纯度试剂； 样品处理步骤简单。 ★样品处理步骤简单。 制备分离方便，定量分析的可靠性较高； ★制备分离方便，定量分析的可靠性较高； 缺点是： 缺点是： 样品有时也须作柱前衍生（但不一定是手性衍生化试剂）， ★样品有时也须作柱前衍生（但不一定是手性衍生化试剂）， 对样品结构有一定限制，其适用性尚不及普通HPLC固定相 ★对样品结构有一定限制，其适用性尚不及普通 固定相 包括正相和反相）那样广泛。 （包括正相和反相）那样广泛。 迄今为止，CSP柱商品已有40多种 价格大多昂贵， 柱商品已有40多种， ★迄今为止，CSP柱商品已有40多种，价格大多昂贵，尚未有一 种具有类似ODS柱的普遍适用性。 ODS柱的普遍适用性 种具有类似ODS柱的普遍适用性。
研究背景
1992年FDA发布手性药物指导原则，要求所有在美国 上市的消旋体新药，生产者均需提供详细报告，说明 药物中所含对映体各自的药理作用、毒性和效果。 显然，单一异构体的试验次数比较单纯，经济上更合 算。 目前普遍使用的2000多种合成药物中有600余种为手 性药物，而活性的单一对映体药物不足100种，其它 500余种都是左右旋混在一起的消旋体药物。 1999年，手性药物市场第一次超过1000亿美元，单一 异构体药物销售额达到1150亿美元，占世界药品市场 3600亿美元的32%。
柱子压力过高
原因：可能是杂质堵住了柱头（frit）。 可更换在线过滤器（in-line filter)或保护 柱，或注射前过滤样品。 由于乙醇、异丙醇粘度大，正常流速下 可能会导致压力过高。可降低流速直至 达到容许的上限。
保护柱
保护分析或半制备柱子免受易于在固定相上吸 附或溶化填料的物质的损坏。 保护柱材料与柱子相同。 以下情况需要更换保护柱： # 失去分离作用； # 峰宽增加； # 脱尾； # 增加体系压力降
间接法：柱前衍生
优点：
*可采用通用的非手性柱分离； *通过衍生化可提高检测灵敏度； *分离条件简单； *分离效果好
缺点：
*要有可被衍生化的基团； *要有高光学纯度的手性试剂； *对个对映体衍生化率速和平衡常数应一致； *衍生化和色谱过程中不能发生消旋化；
直接法：
手性流动相添加剂（CMPA）法： （又可称为手性 手性流动相(CMP)拆分法或手性 手性洗脱法） 手性 手性 & 环糊精(Cyclodextrins)类（主要是α-、β-和γ-环糊精及其
常用的手性药物测定技术
高效液相色谱 (HPLC)
气相色谱 (GC)(样品需具有一定的挥发性及热稳 定性） 毛细管电泳(HPCE) 超临界流体色谱（SFC)
HPLC
80年代初HPLC法迅速成为药物对映体分 离和测定最为广泛应用的方法。 特别适用于极性强、热稳定性差的手性 药物的分析。 HPLC用于手性分离概括起来可分为两大 途径：间接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方 法。
合适的CSP柱
在手性拆分中，温度 温度的影响是很显著的。低温增加手性识别能力， 温度 但可能引起色谱峰变宽而导致分离变差。因此确定手性分析方法 过程中要考虑柱温的影响，确定最优柱温。 根据分子结构 分子结构选择合适的CSP柱是非常重要的。 分子结构 Chiral Technologies Europe(法国)和Chiral Technologies(美国， 是日本Daicel化学工业公司的全资子公司 )是专门为制药和农业 化学及相关工业提供对映体分离服务的公司。服务的领域包括分 析方法的开发和cGMP吨级单一对映体的分离和商业规模工艺的开 发等。 手性聚合物固定相商品柱主要是日本Daicel公司制造的Chiralcel柱。 Daicel固定相的广泛选择性和高负载性能，使Chiral Technologies 及整个Daicel集团成为手性色谱产品和服务市场的领先者。Daicel 的手性固定相是以纤维素为基础的，如将甲酰(3，5-二甲苯胺)基 引入纤维素的羟基。
经验
CHIRALPAK AD-H >CHIRALCEL OD-H(50-60%) >CHIRALCEL OJ-H # CHIRALPAK AS-H (20%)
DAICEL 柱使用的溶剂
流动相采用烷烃-醇混合物体系（主要是正己烷 正己烷 -异丙醇 异丙醇），极性溶剂乙醇、甲醇、乙腈容许 异丙醇 存在。 以下溶剂一点也不可以存在（会破坏柱子）： 丙酮、氯仿、 丙酮、氯仿、DMF、DMSO、THF、甲苯、乙 、 、 、甲苯、 酸乙酯、二氯甲烷、 酸乙酯、二氯甲烷、吡啶
流动相添加剂
酸性化合物：TFA>乙酸、甲酸 碱性化合物：DEA>乙醇胺、丁醇胺 加入量0.1％-0.2％，不超过0.5％。 ％ ％ 柱子稳定的PH范围：2.0-7.0。
样品溶解性
样品含量0.5mg/ml—1.0mg/ml. 酸性化合物和碱性盐，可加添加剂来增加样品 的溶解性。 仍不好溶，可溶于100％醇（甲醇、乙醇、异 丙醇）;若流动相中有烷烃则不可用乙腈 若流动相中有烷烃则不可用乙腈. 若流动相中有烷烃则不可用乙腈 水溶性化合物最好用反相柱，如OD-R、ODRH、OJ-RH、AD-RH、AS-RH; 可用醇-水、乙 腈-水作流动相。
液相色谱法分离手性药物
直接法（CMPA、CSP）：
对映体之一与手性固定相或手性流动相添加剂间发生 分子间的三点作用（较稳定），另一对映体发生两点 作用；形成暂时的非对映异构体的结合物质，通过洗 脱分离。
间接法（CDR)
又称为非对映体拆分法或柱前手性 手性衍生化法 手性 对映体混合物在预处理中进行柱前衍生组成一对非对 映体(Diastereoisomers) ，依其理化性质的差异，在非 手性柱上得以分离。
液相色谱法分离手性 药物
刘志英 2004.11.23
ห้องสมุดไป่ตู้念
许多药物中存在着分子组成与构造完全相同但 分子的立体结构不同的化合物，他们是立体异 构体，不能完全叠合但能互为镜像，（如左手 与右手），这就是手性 手性(chirality)。 手性
O N
∗
NH O
O
O
沙利度胺 （反 应停）
手性药物
药物作用的靶分子都是手性的，因此药物分子与靶分 子的不对称性必须相匹配（手性识别 手性识别－手与手套）。 手性识别 另外，分子药理学研究发现，含有手性因素的化学药 物对映体，在人体内的药理活性、代谢过程和毒性存 在着显著差异。在通常情况下，只有一个对映体具有 药理作用，而另一个对映体不仅无药理作用，还会产 生一定副作用。 如20世纪60年代，镇静药反应停（thalidomide,沙利度 胺）的消旋体用作缓解妊辰反应作用，后来发现在欧 洲服用过的孕妇不少产下海豚状畸形儿。随后研究表 明：反应停右旋体（R型）有镇静作用，左旋体（S型) 具有胚胎毒性和致畸作用。
常用的手性固定相（CSP）法
& 刷（Brush）型或称为Prikle型 & 手性聚合物固定相（如纤维素、淀粉，合成的手性 手性聚合物固定相（如纤维素、淀粉，
聚合物） 聚合物）； & 含肽或蛋白质手性固定相； 含环糊精（Cyclodextrin）及其衍生物的手性固定 相；
&
& 大环抗生素（Macrocyclic antibiotics）型 & 配位交换（|Ligand exchange）型 & 冠醚（Crown ethers）型
手性聚合物固定相Chiralcel柱类型与应用
手性聚合物固定相Chiralcel柱类型与应用 柱类型与应用 手性聚合物固定相 固定相， 固定相 ， 官能团 柱型号 Chiralcel OA 纤维素三乙酯 Chiralcel OB 纤维素三苯甲酸酯 Chiralcel OC 纤维素三苯氨基甲酸酯 纤维素（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯） Chiralcel OD Chiralcel OE 纤维素二苄醚 Chiralcel OF 纤维素三（对氯苯基氨基甲酸酯） Chiralcel OG 纤维素三（对甲苯基氨基甲酸酯） Chiralcel OJ 纤维素三（对甲苯基甲酸酯） Chiralcel OK 纤维素三肉桂酸酯 淀粉三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯） Chiralcel AD 淀粉三（S）-1-苯乙基氨基甲酸酯） Chiralcel AS Chiralcel OT(+) 聚三苯甲基乙丁烯酸酯 Chiralcel O(+) 聚吡啶二苯甲基乙丁烯酸酯 拆分化合物类型 脂肪酸族小分子化合物 脂肪酸族和芳香族小分子化合物 环戊烯酮类 生物碱， 莨菪碱， 生物碱 ， 胺 ， 莨菪碱 ， β － 受体拮抗剂 芳香化合物 内酰胺， 生物碱， β － 内酰胺 ， 生物碱 ， 二氢吡啶 内酰胺， β － 内酰胺 ， 生物碱 甲基芳基酯， 甲基芳基酯 ， 甲氧基芳基酯 芳香化合物 生物碱， 莨菪碱， 生物碱 ， 胺 ， 莨菪碱 ， β － 受体拮抗剂 生物碱， 生物碱 ， 胺 ， 莨菪碱 酰胺， 含磷化合物， 酯 ， 酰胺 ， 含磷化合物 ， 芳香化合物 酰胺， 酯 ， 酰胺 ， 含磷化合物
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手性固定相（CSP）法
手性固定相（CSP）法
优点是： 优点是： 能广泛适用于各类化合物，适于常规及生物样品的分析测定；； ★能广泛适用于各类化合物，适于常规及生物样品的分析测定；； 除非必须衍生化，否则无需高光学纯度试剂； ★除非必须衍生化，否则无需高光学纯度试剂； 样品处理步骤简单。 ★样品处理步骤简单。 制备分离方便，定量分析的可靠性较高； ★制备分离方便，定量分析的可靠性较高； 缺点是： 缺点是： 样品有时也须作柱前衍生（但不一定是手性衍生化试剂）， ★样品有时也须作柱前衍生（但不一定是手性衍生化试剂）， 对样品结构有一定限制，其适用性尚不及普通HPLC固定相 ★对样品结构有一定限制，其适用性尚不及普通 固定相 包括正相和反相）那样广泛。 （包括正相和反相）那样广泛。 迄今为止，CSP柱商品已有40多种 价格大多昂贵， 柱商品已有40多种， ★迄今为止，CSP柱商品已有40多种，价格大多昂贵，尚未有一 种具有类似ODS柱的普遍适用性。 ODS柱的普遍适用性 种具有类似ODS柱的普遍适用性。
研究背景
1992年FDA发布手性药物指导原则，要求所有在美国 上市的消旋体新药，生产者均需提供详细报告，说明 药物中所含对映体各自的药理作用、毒性和效果。 显然，单一异构体的试验次数比较单纯，经济上更合 算。 目前普遍使用的2000多种合成药物中有600余种为手 性药物，而活性的单一对映体药物不足100种，其它 500余种都是左右旋混在一起的消旋体药物。 1999年，手性药物市场第一次超过1000亿美元，单一 异构体药物销售额达到1150亿美元，占世界药品市场 3600亿美元的32%。
柱子压力过高
原因：可能是杂质堵住了柱头（frit）。 可更换在线过滤器（in-line filter)或保护 柱，或注射前过滤样品。 由于乙醇、异丙醇粘度大，正常流速下 可能会导致压力过高。可降低流速直至 达到容许的上限。
保护柱
保护分析或半制备柱子免受易于在固定相上吸 附或溶化填料的物质的损坏。 保护柱材料与柱子相同。 以下情况需要更换保护柱： # 失去分离作用； # 峰宽增加； # 脱尾； # 增加体系压力降
间接法：柱前衍生
优点：
*可采用通用的非手性柱分离； *通过衍生化可提高检测灵敏度； *分离条件简单； *分离效果好
缺点：
*要有可被衍生化的基团； *要有高光学纯度的手性试剂； *对个对映体衍生化率速和平衡常数应一致； *衍生化和色谱过程中不能发生消旋化；
直接法：
手性流动相添加剂（CMPA）法： （又可称为手性 手性流动相(CMP)拆分法或手性 手性洗脱法） 手性 手性 & 环糊精(Cyclodextrins)类（主要是α-、β-和γ-环糊精及其
常用的手性药物测定技术
高效液相色谱 (HPLC)
气相色谱 (GC)(样品需具有一定的挥发性及热稳 定性） 毛细管电泳(HPCE) 超临界流体色谱（SFC)
HPLC
80年代初HPLC法迅速成为药物对映体分 离和测定最为广泛应用的方法。 特别适用于极性强、热稳定性差的手性 药物的分析。 HPLC用于手性分离概括起来可分为两大 途径：间接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方 法。
合适的CSP柱
在手性拆分中，温度 温度的影响是很显著的。低温增加手性识别能力， 温度 但可能引起色谱峰变宽而导致分离变差。因此确定手性分析方法 过程中要考虑柱温的影响，确定最优柱温。 根据分子结构 分子结构选择合适的CSP柱是非常重要的。 分子结构 Chiral Technologies Europe(法国)和Chiral Technologies(美国， 是日本Daicel化学工业公司的全资子公司 )是专门为制药和农业 化学及相关工业提供对映体分离服务的公司。服务的领域包括分 析方法的开发和cGMP吨级单一对映体的分离和商业规模工艺的开 发等。 手性聚合物固定相商品柱主要是日本Daicel公司制造的Chiralcel柱。 Daicel固定相的广泛选择性和高负载性能，使Chiral Technologies 及整个Daicel集团成为手性色谱产品和服务市场的领先者。Daicel 的手性固定相是以纤维素为基础的，如将甲酰(3，5-二甲苯胺)基 引入纤维素的羟基。
经验
CHIRALPAK AD-H >CHIRALCEL OD-H(50-60%) >CHIRALCEL OJ-H # CHIRALPAK AS-H (20%)
DAICEL 柱使用的溶剂
流动相采用烷烃-醇混合物体系（主要是正己烷 正己烷 -异丙醇 异丙醇），极性溶剂乙醇、甲醇、乙腈容许 异丙醇 存在。 以下溶剂一点也不可以存在（会破坏柱子）： 丙酮、氯仿、 丙酮、氯仿、DMF、DMSO、THF、甲苯、乙 、 、 、甲苯、 酸乙酯、二氯甲烷、 酸乙酯、二氯甲烷、吡啶
流动相添加剂
酸性化合物：TFA>乙酸、甲酸 碱性化合物：DEA>乙醇胺、丁醇胺 加入量0.1％-0.2％，不超过0.5％。 ％ ％ 柱子稳定的PH范围：2.0-7.0。
样品溶解性
样品含量0.5mg/ml—1.0mg/ml. 酸性化合物和碱性盐，可加添加剂来增加样品 的溶解性。 仍不好溶，可溶于100％醇（甲醇、乙醇、异 丙醇）;若流动相中有烷烃则不可用乙腈 若流动相中有烷烃则不可用乙腈. 若流动相中有烷烃则不可用乙腈 水溶性化合物最好用反相柱，如OD-R、ODRH、OJ-RH、AD-RH、AS-RH; 可用醇-水、乙 腈-水作流动相。
液相色谱法分离手性药物
直接法（CMPA、CSP）：
对映体之一与手性固定相或手性流动相添加剂间发生 分子间的三点作用（较稳定），另一对映体发生两点 作用；形成暂时的非对映异构体的结合物质，通过洗 脱分离。
间接法（CDR)
又称为非对映体拆分法或柱前手性 手性衍生化法 手性 对映体混合物在预处理中进行柱前衍生组成一对非对 映体(Diastereoisomers) ，依其理化性质的差异，在非 手性柱上得以分离。
液相色谱法分离手性 药物
刘志英 2004.11.23
ห้องสมุดไป่ตู้念
许多药物中存在着分子组成与构造完全相同但 分子的立体结构不同的化合物，他们是立体异 构体，不能完全叠合但能互为镜像，（如左手 与右手），这就是手性 手性(chirality)。 手性
O N
∗
NH O
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沙利度胺 （反 应停）
手性药物
药物作用的靶分子都是手性的，因此药物分子与靶分 子的不对称性必须相匹配（手性识别 手性识别－手与手套）。 手性识别 另外，分子药理学研究发现，含有手性因素的化学药 物对映体，在人体内的药理活性、代谢过程和毒性存 在着显著差异。在通常情况下，只有一个对映体具有 药理作用，而另一个对映体不仅无药理作用，还会产 生一定副作用。 如20世纪60年代，镇静药反应停（thalidomide,沙利度 胺）的消旋体用作缓解妊辰反应作用，后来发现在欧 洲服用过的孕妇不少产下海豚状畸形儿。随后研究表 明：反应停右旋体（R型）有镇静作用，左旋体（S型) 具有胚胎毒性和致畸作用。
常用的手性固定相（CSP）法
& 刷（Brush）型或称为Prikle型 & 手性聚合物固定相（如纤维素、淀粉，合成的手性 手性聚合物固定相（如纤维素、淀粉，
聚合物） 聚合物）； & 含肽或蛋白质手性固定相； 含环糊精（Cyclodextrin）及其衍生物的手性固定 相；
&
& 大环抗生素（Macrocyclic antibiotics）型 & 配位交换（|Ligand exchange）型 & 冠醚（Crown ethers）型
手性聚合物固定相Chiralcel柱类型与应用
手性聚合物固定相Chiralcel柱类型与应用 柱类型与应用 手性聚合物固定相 固定相， 固定相 ， 官能团 柱型号 Chiralcel OA 纤维素三乙酯 Chiralcel OB 纤维素三苯甲酸酯 Chiralcel OC 纤维素三苯氨基甲酸酯 纤维素（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯） Chiralcel OD Chiralcel OE 纤维素二苄醚 Chiralcel OF 纤维素三（对氯苯基氨基甲酸酯） Chiralcel OG 纤维素三（对甲苯基氨基甲酸酯） Chiralcel OJ 纤维素三（对甲苯基甲酸酯） Chiralcel OK 纤维素三肉桂酸酯 淀粉三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯） Chiralcel AD 淀粉三（S）-1-苯乙基氨基甲酸酯） Chiralcel AS Chiralcel OT(+) 聚三苯甲基乙丁烯酸酯 Chiralcel O(+) 聚吡啶二苯甲基乙丁烯酸酯 拆分化合物类型 脂肪酸族小分子化合物 脂肪酸族和芳香族小分子化合物 环戊烯酮类 生物碱， 莨菪碱， 生物碱 ， 胺 ， 莨菪碱 ， β － 受体拮抗剂 芳香化合物 内酰胺， 生物碱， β － 内酰胺 ， 生物碱 ， 二氢吡啶 内酰胺， β － 内酰胺 ， 生物碱 甲基芳基酯， 甲基芳基酯 ， 甲氧基芳基酯 芳香化合物 生物碱， 莨菪碱， 生物碱 ， 胺 ， 莨菪碱 ， β － 受体拮抗剂 生物碱， 生物碱 ， 胺 ， 莨菪碱 酰胺， 含磷化合物， 酯 ， 酰胺 ， 含磷化合物 ， 芳香化合物 酰胺， 酯 ， 酰胺 ， 含磷化合物