第5章正常细胞培养技术miao
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第5章正常细胞培养技术miao
(八) 口腔粘膜上皮细胞培养
口腔粘膜上皮为复层鳞状上皮，体外培养 口腔粘膜上皮细胞的关键是：用胶原酶消 化法使鳞状上皮细胞层与底层的间质分开， 再进一步用胰蛋白酶消化法使鳞状上皮细 胞分离为单细胞悬液，然后在角化细胞培 养液(KGM)中培养。
第5章正常细胞培养技术miao
(二)乳腺上皮细胞分离培养
乳腺主要由腺上皮组成，早期乳汁或 断奶后的乳汁含有上皮细胞团块，可 用离心法收集上皮细胞，培养时常用 人胚小肠成纤维细胞作饲养层可抑制 间质细胞生长。
第5章正常细胞培养技术miao
(1) 取材， 于产后2~7天收集乳汁1:1的 比例与培养基混合。 (2) 低速离心，仔细去除上清，收集细 胞。 (3) 细胞洗涤后置于培养瓶中培养。 (4) 3~5天更换培养基，待细胞长满后可 消化、传代 。
上皮细胞培养有三个难点：
需特殊底物 如需在底层涂以胶原或铺 上饲养层细胞，以利于生长。
需特殊的培养液 如加浓缩维生素及氨 基酸的EMEM及KGM（培养消化上皮 细胞）、EGM（培养一般上皮细胞） 等，价格昂贵。
与上皮细胞混杂的成纤维细胞的过度 生长，常常干扰上皮细胞在体外的培 养使其难以长期生存。
第5章正常细胞培养技术miao
为此，需要从表皮分离、培养液和基 质底物的选择、增加适当生长因子等 方面着手，以抑制成纤维细胞生长， 促进上皮细胞生长。由此可见，要纯 化和延长上皮细胞生存期，抑制成纤 维细胞生长或去除（或减少）成纤维 细胞是上皮细胞培养成功的关键。
第5章正常细胞培养技术miao
(一)表皮细胞分离与培养
第5章正常细胞培养技术miao
表皮细胞生长融合成片，并向复层发展
第5章正常细胞培养技术miao
表皮细胞贴壁生长，呈多边形，不规则
第5章正常细胞培养技术miao
第5章正常细胞培养技术miao
(三)子宫颈上皮细胞分离培养
子宫颈上皮细胞体外培养在细胞癌前 病变及致癌的研究中有重要意义 。
常用组织块法进行原代培养，传代培 养需用经照射或丝裂霉素C处理的3T3 细胞作滋养层。培养液需添加适当的 刺激生长的添加物。
上皮细胞可来源于外、内、中三个胚 层，其中来源于内外胚层的上皮细胞 可呈膜状生长。不同器官的上皮细胞 均具有不同的特定的功能，培养上皮 细胞不仅有利于研究其功能，还可为 烧伤、烫伤的皮肤进行上皮膜层移植， 加速伤口愈合，不留疤痕，在皮肤美 容方面也具有潜在的应用价值。
第5章正常细胞培养技术miao
第5章正常细胞培养技术miao
(5) 用乳腺细胞培养上皮细胞时，注意： ①应尽可能去除脂肪组织，②如果标本 中纤维组织较多，可用胶原酶消化法获 取细胞，③初时有巨噬细胞存在，可作 饲养层细胞，④培养时也可用经照射或 用丝裂霉素C处理过的3T3细胞作饲养 层细胞，或用胶原层，⑤培养液中也可 加刺激生长因子如EGF、胰岛素、氢化 可的松、猪促乳素和前列腺素E1等，有 利于细胞生长繁殖。
(六) 气管及支气管上皮细胞分离培养
在血清存在条件下，正常人气管上皮 细胞停止分裂和生长分化，因此需用 无血清培养基(LHC-9),可使组织碎块 的气管上皮细胞生长，并且抑制纤维 细胞生长。
第5章正常细胞培养技术miao
(七) 前列腺细胞培养
前列腺细胞的培养，关键是改良培养 液的成分，加入激素样生长因子，以 刺激前列腺细胞生长，抑制纤维细胞 生长，可用于研究前列腺的生长和功 能。
第5章正常细胞培养技术miao
（1）收集活检标本， 尽可能防止污染。 （2）洗涤、剪碎，去除纤维组织。 （3）37℃培养10天以上，组织块贴壁，
加入EGF并用此培养液换液。 （4）消化、分散、传代培养。
第5章正常细胞培养技术miao
(四) 肝细胞分离培养
可用组织块法和原位灌注消化法收获肝细胞 进行原代培养，其形态规则，适于作多种功 能的研究。
第五章 正常细胞的培养技术
第5章正常细胞培养技术miao
正常细胞，不论是来自人或动物的细 胞，在体外培养时都不易生长，建立 细胞系更难，因为它们是已分化的细 胞，对体外生存条件要求严格，目前 体外模拟的培养条件都还达不到与体 内相一致的要求。正常细胞在体外并 非不能培养，只要各种条件适当仍然 有培养成功的可能，初代培养较传代 细胞系容易。
肝脏原位灌注消化法：从门静脉或其分支中 插管，用无钙、镁PBS冲洗肝脏15分钟，然后 用胶原酶液灌注15分钟，使纤维组织网被消 化，经过2~3次离心分离，可获得大量肝细胞 悬液。
培养时可将肝细胞接种在游离漂浮的胶原薄 片上，细胞能较好地表达其功能 。
第5章正常细胞培养技术miao
(五) 胰腺细胞分离
将获取的胰脏标本修剪切碎后消化， 并使之浮于牛血清白蛋白溶液上，经 过3次离心分离收集细胞，在水浴槽中 用旋转法使细胞聚集（2～24h），接 种涂布了胶原的培养皿，可获得体外 培养的胰腺细胞。
此法可用于家鼠和人胰腺细胞培养， 培养时采wk.baidu.com照射过的肺成纤维细胞作 为饲养层，效果更佳。
第5章正常细胞培养技术miao
皮肤是表皮细胞的重要来源，小儿阴 茎包皮是表皮培养的好材料。目前， 全皮培养混有大量成纤维细胞，因而 不采用，常采用皮肤表皮和真皮分离 培养法可获得纯上皮细胞。
第5章正常细胞培养技术miao
（1）无菌条件下切取皮肤标本，以角化 层薄者为佳，早产、流产胎儿皮肤更好。 （2）将皮块置于消化液中进行消化，此 时表皮层与真皮层自然分离，表皮层为浅 棕色，真皮层为白色。 （3）取出表皮层再进行第二次消化 。 （4）待充分消化后，剪碎移至瓶内加入 适量培养液，吹打分散制成细胞悬液，用 不锈钢纱网过滤，调整细胞浓度，用含 15%胎牛血清的培养液进行分瓶培养，3 天后可见大部分上皮细胞贴壁生长。
第5章正常细胞培养技术miao
正常细胞培养可用于许多方面，如 研究细胞代谢、物理、化学、生物 因素的影响，作为 观察和检测手段 研究活细胞的变化（变异、分化）， 可从细胞水平开展亚细胞结构和代 谢分子的表达，也可大量培养用于 生物制品的生产，等等。
第5章正常细胞培养技术miao
一、上皮细胞培养
(八) 口腔粘膜上皮细胞培养
口腔粘膜上皮为复层鳞状上皮，体外培养 口腔粘膜上皮细胞的关键是：用胶原酶消 化法使鳞状上皮细胞层与底层的间质分开， 再进一步用胰蛋白酶消化法使鳞状上皮细 胞分离为单细胞悬液，然后在角化细胞培 养液(KGM)中培养。
第5章正常细胞培养技术miao
(二)乳腺上皮细胞分离培养
乳腺主要由腺上皮组成，早期乳汁或 断奶后的乳汁含有上皮细胞团块，可 用离心法收集上皮细胞，培养时常用 人胚小肠成纤维细胞作饲养层可抑制 间质细胞生长。
第5章正常细胞培养技术miao
(1) 取材， 于产后2~7天收集乳汁1:1的 比例与培养基混合。 (2) 低速离心，仔细去除上清，收集细 胞。 (3) 细胞洗涤后置于培养瓶中培养。 (4) 3~5天更换培养基，待细胞长满后可 消化、传代 。
上皮细胞培养有三个难点：
需特殊底物 如需在底层涂以胶原或铺 上饲养层细胞，以利于生长。
需特殊的培养液 如加浓缩维生素及氨 基酸的EMEM及KGM（培养消化上皮 细胞）、EGM（培养一般上皮细胞） 等，价格昂贵。
与上皮细胞混杂的成纤维细胞的过度 生长，常常干扰上皮细胞在体外的培 养使其难以长期生存。
第5章正常细胞培养技术miao
为此，需要从表皮分离、培养液和基 质底物的选择、增加适当生长因子等 方面着手，以抑制成纤维细胞生长， 促进上皮细胞生长。由此可见，要纯 化和延长上皮细胞生存期，抑制成纤 维细胞生长或去除（或减少）成纤维 细胞是上皮细胞培养成功的关键。
第5章正常细胞培养技术miao
(一)表皮细胞分离与培养
第5章正常细胞培养技术miao
表皮细胞生长融合成片，并向复层发展
第5章正常细胞培养技术miao
表皮细胞贴壁生长，呈多边形，不规则
第5章正常细胞培养技术miao
第5章正常细胞培养技术miao
(三)子宫颈上皮细胞分离培养
子宫颈上皮细胞体外培养在细胞癌前 病变及致癌的研究中有重要意义 。
常用组织块法进行原代培养，传代培 养需用经照射或丝裂霉素C处理的3T3 细胞作滋养层。培养液需添加适当的 刺激生长的添加物。
上皮细胞可来源于外、内、中三个胚 层，其中来源于内外胚层的上皮细胞 可呈膜状生长。不同器官的上皮细胞 均具有不同的特定的功能，培养上皮 细胞不仅有利于研究其功能，还可为 烧伤、烫伤的皮肤进行上皮膜层移植， 加速伤口愈合，不留疤痕，在皮肤美 容方面也具有潜在的应用价值。
第5章正常细胞培养技术miao
第5章正常细胞培养技术miao
(5) 用乳腺细胞培养上皮细胞时，注意： ①应尽可能去除脂肪组织，②如果标本 中纤维组织较多，可用胶原酶消化法获 取细胞，③初时有巨噬细胞存在，可作 饲养层细胞，④培养时也可用经照射或 用丝裂霉素C处理过的3T3细胞作饲养 层细胞，或用胶原层，⑤培养液中也可 加刺激生长因子如EGF、胰岛素、氢化 可的松、猪促乳素和前列腺素E1等，有 利于细胞生长繁殖。
(六) 气管及支气管上皮细胞分离培养
在血清存在条件下，正常人气管上皮 细胞停止分裂和生长分化，因此需用 无血清培养基(LHC-9),可使组织碎块 的气管上皮细胞生长，并且抑制纤维 细胞生长。
第5章正常细胞培养技术miao
(七) 前列腺细胞培养
前列腺细胞的培养，关键是改良培养 液的成分，加入激素样生长因子，以 刺激前列腺细胞生长，抑制纤维细胞 生长，可用于研究前列腺的生长和功 能。
第5章正常细胞培养技术miao
（1）收集活检标本， 尽可能防止污染。 （2）洗涤、剪碎，去除纤维组织。 （3）37℃培养10天以上，组织块贴壁，
加入EGF并用此培养液换液。 （4）消化、分散、传代培养。
第5章正常细胞培养技术miao
(四) 肝细胞分离培养
可用组织块法和原位灌注消化法收获肝细胞 进行原代培养，其形态规则，适于作多种功 能的研究。
第五章 正常细胞的培养技术
第5章正常细胞培养技术miao
正常细胞，不论是来自人或动物的细 胞，在体外培养时都不易生长，建立 细胞系更难，因为它们是已分化的细 胞，对体外生存条件要求严格，目前 体外模拟的培养条件都还达不到与体 内相一致的要求。正常细胞在体外并 非不能培养，只要各种条件适当仍然 有培养成功的可能，初代培养较传代 细胞系容易。
肝脏原位灌注消化法：从门静脉或其分支中 插管，用无钙、镁PBS冲洗肝脏15分钟，然后 用胶原酶液灌注15分钟，使纤维组织网被消 化，经过2~3次离心分离，可获得大量肝细胞 悬液。
培养时可将肝细胞接种在游离漂浮的胶原薄 片上，细胞能较好地表达其功能 。
第5章正常细胞培养技术miao
(五) 胰腺细胞分离
将获取的胰脏标本修剪切碎后消化， 并使之浮于牛血清白蛋白溶液上，经 过3次离心分离收集细胞，在水浴槽中 用旋转法使细胞聚集（2～24h），接 种涂布了胶原的培养皿，可获得体外 培养的胰腺细胞。
此法可用于家鼠和人胰腺细胞培养， 培养时采wk.baidu.com照射过的肺成纤维细胞作 为饲养层，效果更佳。
第5章正常细胞培养技术miao
皮肤是表皮细胞的重要来源，小儿阴 茎包皮是表皮培养的好材料。目前， 全皮培养混有大量成纤维细胞，因而 不采用，常采用皮肤表皮和真皮分离 培养法可获得纯上皮细胞。
第5章正常细胞培养技术miao
（1）无菌条件下切取皮肤标本，以角化 层薄者为佳，早产、流产胎儿皮肤更好。 （2）将皮块置于消化液中进行消化，此 时表皮层与真皮层自然分离，表皮层为浅 棕色，真皮层为白色。 （3）取出表皮层再进行第二次消化 。 （4）待充分消化后，剪碎移至瓶内加入 适量培养液，吹打分散制成细胞悬液，用 不锈钢纱网过滤，调整细胞浓度，用含 15%胎牛血清的培养液进行分瓶培养，3 天后可见大部分上皮细胞贴壁生长。
第5章正常细胞培养技术miao
正常细胞培养可用于许多方面，如 研究细胞代谢、物理、化学、生物 因素的影响，作为 观察和检测手段 研究活细胞的变化（变异、分化）， 可从细胞水平开展亚细胞结构和代 谢分子的表达，也可大量培养用于 生物制品的生产，等等。
第5章正常细胞培养技术miao
一、上皮细胞培养