高效体积排阻色谱与多角激光光散射仪联机测定低分子肝素分子量及分子量分布

Chin Pharm J ，2009 January ，Vol. 44 No. 2 中国药学杂志2009年1月第44卷第2期 ·140·

作者简介：李京，女，主管药师 研究方向：多糖类药物质量控制 Tel ：010）67095305 E-mail ：lijing317@

0.4 mg·kg -1负荷剂量静脉推注后以0.4和0.8 mg·kg -1·h -1的速度连续6 h 静脉输注给药，尼非卡兰在连续给药约4 h 后达稳态血浆浓度，分别为543和2 133 µg·L -1，AUC 值与给药剂量呈线性相关性。本试验0.3，0.4 mg·kg -1静脉推注及0.4 mg·kg -1·h -1连续维持静脉输注后，尼非卡兰ρmax 与AUC 值与剂量呈线性相关性，t 1/2分别为（1.55±0.38）， （1.34 ±0.19）和（1.35±0.23）h ，各给药组间无统计学差异（P >0.05）。与文献相比，尼非卡兰主要药动学参数无统计学差异。

本试验建立了尼非卡兰健康人体血浓度高效液相色谱测定方法，270 nm 波长检测，空白血浆中

内源性物质不干扰测定。该法简单，灵敏度高，专属性强，适合尼非卡兰人体内血浓度测定及其药动学研究。整个试验过程顺利，静脉推注和静脉输注给药志愿者无不良反应发生。

REFERENCES

[1]

KAMIYA J, ISHII M, KATAKAMI T, et al . Antiarrhythmic effects of

MS-551, a new class Ⅲ antiarrhythmic agent, on canine models of ventricular arrhythmia[J]. Japan J Pharmacol , 1992，58(2)：107-115. [2] ZHANG D P, HUANG C L. Determination of nifikalant

hydrochloride by HPLC[J]. Nothwest Pharm J （西北药学杂志），2004(3)：99-101.

（收稿日期：2008-02-24）

高效体积排阻色谱与多角激光光散射仪联机测定低分子肝素分子量及分子量分布

李京，范慧红（中国药品生物制品检定所，北京 100050）

摘要：目的 测定低分子肝素的分子量及其分布。方法 高效体积排阻色谱，以0.2 mol·L -1硫酸钠水溶液(pH 5.0)为流动相，TSK-GEL G2000SW xl 凝胶色谱柱，示差折光检测器与多角激光光散射仪联用。结果 获得了供试品的分子量与分子量分布，并与《欧洲药典》中规定的高效体积排阻色谱法的测定结果比较，结果一致。结论 本法不需要分子量对照品，可以直接测定低分子肝素分子量及其分布，快速简便，结果该确。 关键词：低分子肝素；分子量；多角激光光散射仪

中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1001-2494(2009)02-0140-03

Determination of Molecular Weight and Molecular Weight Distribution of Low Molecular Weight Heparin by High Performance Size Exclusion Chromatograghy with Multiangle Laser Light Scatter

LI Jing ，FAN Hui-hong (National Institute for the Control of Pharmaceutical & Biological Products ，Beijing 100050，China )

ABSTRACT ：OBJECTIVE To determine the molecular weight and molecular weight distribution of low molecular weight heparin(LMWH). METHODS A high performance size exclusion chromatograghy(HPSEC) in conjunction with refractive index detector and mutiangle laser light scatter(MALLS)，was performed on a TSK-GEL G2000SW xl column ，using 0.2 mol •L -1(pH 5.0) sodium sulfate as mobile phase. RESULTS The molecular weight and molecular weight distribution obtained by HPSEC/MALLS were complied with HPSEC of European Pharmacopoeia. CONCLUSION HPSEC/MALLS can directly determine the absolute weight and the distribution of LMWH without molecular calibrants ，and the method is fast ，simple and accurate. KEY WORDS ：low molecular weight heparin; molecular weight; MALLS

低分子肝素（low molecular weight heparin ，LMWH ）目前已广泛应用于预防和治疗血栓，它是以肝素为原料，以物理、化学或生物的方法将其分

级或降解，得到的具有较低分子量的组分或片段。分子量及分子量分布是每一种LMWH 产品的定义性特征，一般要求重均分子量小于8 000。

在国际通用药典中，只有《欧洲药典》（EP）[1]规定了LMWH的分子量测定方法，为高效体积排阻色谱法（HPSEC）。该方法需要使用经特殊制备的具有紫外吸收的分子量对照品，紫外检测器（UV）和示差折光检测器（RI）联用测定样品的分子量及分布。本实验建立的高效体积排阻色谱与多角激光光散射（MALLS）仪联机测定法（HPSEC/MALLS），将MALLS作为HPSEC的第二检测器，由于MALLS为分子量响应型检测器，因此不需要对照品校正色谱柱，可直接测得样品的绝对分子量。国外虽然已有报道[2]，国内还未见相关文献。

光散射（LS）技术用于大分子物质分子量测定开始于上世纪80年代。这种方法对于任何具有一定分子量范围的高分子试样，无论其在流动相中的分子状态如何，由RI和LS两种检测器联用，可以获得样品洗脱图中每一部分点的重均分子量，其分子量测定范围约为103~109。本实验采用HPSEC/MALLS法方法原理[3]。

该方法不仅高效、准确，而且还可以获到样品在溶液中的结构形态信息。使用HPSEC/MALLS法对15批LMWH样品进行测定，并将结果与EP中的HPSEC法进行比较。

1 仪器

1.1 HPSEC/MALLS法

日本岛津公司LC-10AD vp型高效液相色谱仪，包括：DGU-14A脱气装置，LC-10A vp泵，SIL-10AD vp自动进样器，CTO-10A vp柱温箱，RID-10A示差折光检测器；美国Wyatte公司miniDAWN®三角度激光光散射仪（波长690 nm）；ASTRA 4.90.08软件。

1.2 HPSEC法

日本岛津公司LC-10AD vp型高效液相色谱仪，包括：DGU-14A脱气装置，LC-10A vp泵，SIL-10AD vp自动进样器，CTO-10A vp柱温箱，SPD-6AV紫外检测器，RID-10A示差折光检测器；龙智达公司数据接口；龙智达药典版GPC 软件。

2试药

贝米肝素注射剂15批（西班牙Laboratorios Farmacéuticos ROVI，S.A药厂）；牛血清白蛋白（中国药品生物制品检定所，批号140619- 200516）；欧洲药典低分子肝素分子量测定用对照品（Mna=3 700，批号1B）；叠氮化钠（Merck），葡萄糖，无水硫酸钠为国产分析纯，氯化钠为优级纯。

3HPSEC/MALLS法实验方法

3.1 色谱条件

色谱柱：TSK-GEL G2000SW xl（7.5 mm×30 cm，5 µm）；流动相：0.2 mol·L-1硫酸钠水溶液（内含0.02％叠氮化钠，以1 mol·L-1硫酸调pH至5.0，0.22 µm滤膜过滤）；流速：0.5 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：200 µL；采集时间：30 min。

3.2 供试品溶液的配制

取供试品适量，加流动相适量稀释至 3 000 U·mL-1。

3.3 各项参数的确定

3.3.1示差检测器常数的测定取氯化钠，加水制成质量浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g·L-1的系列溶液，用注射器依次将溶液注入RI检测池，记录信号与浓度响应曲线（V-C），由曲线斜率计算得到RI常数为7.762 4×104。

3.3.2延迟体积的测定取牛血清白蛋白，加流动相配制成10 g·L-1的溶液，进样测定，计算MALLS 和RI之间的延迟体积，为0.142 mL。

3.3.3信号归一化（Normalization）由于各检测角度对激光散射信号的响应存在差异，每一次测定前要求以90°测定单分散小分子的散射信号为基准，对其他角度信号进行校正。取牛血清白蛋白，加流动相配制成10 g·L-1的溶液，进样测定。校正结果是41.5°的校正系数为0.703，138.5°的校正系数为0.692。

3.3.4 d n/d c值由于我们实验室没有d n/d c仪，不能直接测定样品的d n/d c值，所以采用文献[2]值0.130。

3.4样品测定

取供试品溶液200 µL，注入液相色谱仪，同时记录MALLS和RI色谱图。经软件计算得出重均分子量M w及分布系数D。

4EP法

参照《欧洲药典》第五版低分子肝素分子量鉴别项下[1]进行操作。用色谱柱TSK-GEL G2000SW xl （7.5 mm×30 cm，5 µm）和TSK-GEL G3000SW （7.5 mm×30 cm，10 µm）分别进行实验。

中国药学杂志2009年1月第44卷第2期Chin Pharm J，2009 January，Vol. 44No. 2·141·