cDNA文库构建
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Ｆｉｇ ４．’Ｉｈｅ矗ｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｏｆ￡ｈｅ ｄｓ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ．
为了得到较长ｃＤＮＡ片段，去掉ｃＤＮＡ双链中 的小片段，采用ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ一４００柱进行了片段
·６２·
杂交水稻（ｍ田脚Ｄ彤ＣＥ），２０１０，２５（２） ２０１０年３月（Ｍａｒ．，２０１０）
大小分级分离（图５）。从图５可见，第９，１０，１１，１２ 号泳道出现明显弥散条带，将９，１０，１１，１２号泳道对 应的４管产物收集合并成ｌ管，以供连接使用。
能互补技术筛选东乡野生稻有利基因奠定了基础。
关键词：东乡野生稻；低温诱导；ｃＤＮＡ文库构建；ＳＭＡＲＴ技术
中图分类号：Ｓ５１１．Ｏｌ；Ｑ７５
文献标识码：Ａ
文章编号：１００５—３９５６１２叭Ｏ）０２一００５９一０４
东乡野生稻是迄今为止世界上分布最北的野生 稻…，能在一１２．８一Ｏ℃低温条件下安全越冬悼Ｊ，具 有众多的优良性状和丰富的遗传多样性。目前已鉴 定出的有利基因有：胞质雄性不育、耐寒、耐旱【３ Ｊ、 耐贫瘠、广亲和性、高产、抗矮缩病、抗黄矮病、抗稻 瘟病、抗螟虫及“野败”恢复基因等。为深入挖掘东 乡野生稻潜在的基因资源，笔者取低温诱导的东乡 野生稻幼苗叶片，采用先进的ＳＭＡＲＴ技术构建了 全长ｃＤＮＡ文库。ｓＭＡＲＴ构建文库技术是目前应 用较广泛的一种建库技术，主要原理是利用反转录 酶、末端转移酶活性、锚定引物和内切酶Ｓｆｉ Ｉ等特 性构建全长ｃＤＮＡ文库。该方法由于所需材料少 （０．０２５—０．５斗ｇ ｍＲＮＡ或者０．０５一１．０¨ｇ总 ＲＮＡ），实验过程快速、简单和全长率较高等优点而 应用广泛，本研究将该技术引进野生稻基因利用领 域，为进一步克隆东乡野生稻功能基因开辟一条新 的途径。
将ｃＤＮＡ片段连接到线性ＹＰｌ３载体。为了探 索最佳的连接效果，采用不同的ｃＤＮＡ用量与ＹＰＬ３ 线性载体进行３个平行的连接反应：Ａ管含ｃＤＮＡ
Ｏ．５斗Ｌ，Ｂ管含ｃＤＮＡ １．０斗Ｌ，Ｃ管含ｃＤＮＡ １．５斗Ｌ， 各管其它试剂用量分别为ＹＰＬ３线性载体１．０斗Ｌ，
１０倍连接缓冲液０．５灿，Ａ，Ｉ．Ｐ ０．５此，Ｔ４ＤＮＡ连接
·６０·
杂交水稻（ｍ侣肋尺，阳），２０１０，２５（２） ２０１０年３月（Ｍａｒ．，２０１０）
图ｌ ＹＰＬ３载体构建流程 Ｆｉｇ １． Ｃｏｎｓｔｍｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ ＹＰＬ３ Ｖｅｃｔｏｒ．
短片段Ａ和长片段Ｂ于１６℃过夜连接，将连接产物 电转人大肠杆菌ＤＨｌ０Ｂ，铺平板（ＬＢ＋ＡＭＰ），挑单 克隆摇菌，提取质粒并用蛳Ｉ酶切鉴定并保存，新 载体命名为ＹＰＬ３（图１）。将新载体用ｓｆｉ Ｉ酶切后 回收并纯化作为文库构建的线性载体备用。 １．２．２东乡野生稻总ＲＮＡ的提取及质量检测
６０ｎ．
图３ 东乡野生稻叶片总ＲＮＡ电泳结果
Ｆｉｇ ３．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆ而ｍ ｌｅａＶｅｓ ｏｆ Ｄｏｎｇ）【ｉａｎｇ ｗｉｌｄ ｒｉｃｅ．
２．３双链ｃＤＮＡ的合成与纯化 取提取的总ＲＮＡ进行反转录和ＬＤ—ＰＣＲ反应
后合成了双链ｃＤＮＡ，经琼脂糖凝胶电泳检测，双链 ｃＤＮＡ片段主要弥散带集中在６００ ｂｐ～４ ｋｂ范围 （图４），说明双链ｃＤＮＡ合成质量高，效果很好，可 以满足全长ｃＤＮＡ文库构建的需求。
杂交水稻（ｍ倡尺仍尺，ｃ层），２０１０，２５（２）：５９—６２
·５９·
低温诱导东乡野生稻幼苗期叶片 ｃＤＮＡ文库的构建和鉴定
李玲龙”，邢俊杰１’２…，崔玲玲１’２，韩小霞１’２，阳志刚１’２，李丁Ｌ２，谢灵灵１，一，曹孟良１’２’３’‘
（１．中南大学研究生院隆平分院，湖南长沙４ｌＯｌ２５；２．长沙杂交水稻基因工程技术研究中心，湖南长沙４１０２０５； ３．国家杂交水稻工程技术研究中心，湖南长沙４１０１２５）
２结果与分析
２．１双元表达载体ＹＰＤ的构建 新构建的载体ＹＰＬ３的蛆Ｉ酶切产物鉴定结果
见图２，载体大小约６ ｋｂ，插入片段约６００ ｂｐ，载体 ＹＰＬ３构建正确。
间。从电泳结果（图３）看，１８Ｓ和２８Ｓ条带清晰，保 温试验前后条带没有变化，说明所提总ＲＮＡ的纯度 和完整性好，可用于文库构建。
注：１为１ ｋｂ ｍａｒｋｅｒ；２为保温前的总ＲＮＡ；３为保温后的总ＲＮＡ。 Ｎｏｃｅ：ｌ ｉｓ ｌ ｋｂ ｍａｒｋｅ‘；２ ｉｓ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ Ｄｏｎｇｘｉａｎｇ ｗｉｌｄ ｒｉｃｅ ｂｅｆｏ他ｈｅａｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ；３ ｉｓ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ Ｄｏｎ铲ｉ帅ｇ ｗｉｌｄ ｒｊｃｅ ａｎｅｒ ｈｅａｔ ｐＩ．ｅ鸵ｎ，ａ－
％ｚｏｌ和感受态细胞ＤＨｌｏＢ购自Ｉｎｖｉ咖ｇｅｎ公
万ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ数据
司，Ｃｒｅａｔｏｒ下Ｍ ｓＭＡＲＴＴＭ ｃＤＮＡ文库构建试剂盒和Ａｄ． ｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ试剂盒购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司，ＱＩＡＥＸⅡ 胶回收试剂盒购自ＱＩＡＧＥＮ公司，Ｓｆｉ Ｉ酶购自宝生 物公司 １．１．３ 引 物
合成ｃＤＮＡ第１链的引物为ｃＤｓⅢ／３ ７ＰｃＲ引 物：５’一ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ—ｄ （Ｔ）３０Ｎ—ｌＮ一３，（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，或Ｔ；Ｎ一１＝Ａ，Ｇ，或Ｃ， ｄ（Ｔ）加代表３０个多聚Ｔ）；合成第ｌ链的锚定引物 为：５，－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴ— ＡｃＧＧＣｃＧＧＧ一３’；合成ｃＤＮＡ第２链的引物为５ ７ ＰＣＲ弓Ｉ物：５ ＬＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－３’。 １．２试验方法 １．２．１双元表达载体ＹＰＬ３的构建
１材料和方法
１．１ 供试材料 １．１．１ 东乡野生稻
将东乡野生稻的多年生宿根移栽到实验室温室 培养，待生长至第１片幼叶长约３０ ｃｍ时，移人冰箱 ８℃低温诱导（冰箱门为透明玻璃，能提供自然光 照）３ ｄ后，剪取叶片，每份约０．２ ｇ，用锡箔纸包装， 置液氮中速冻，然后一８０℃保存备用。 １．１．２主要试剂和酶
２．４文库的构建与质量检测 将Ａ、Ｂ、Ｃ ３管平行的连接产物去盐纯化后分
别电转到感受态大肠杆菌中，成功构建了３个原始 ｃＤＮＡ文库。经测定，３个文库的滴度分别为５．２× １０７，７．４×１０。７和７×１０６ ｃｆ∥ｍＬ，平均滴度为４．４× １０７ ｃｆ∥ｍＬ。挑取１６个单克隆进行重组率检测，结 果（图６）显示，１６个样品中均有条带出现，文库的 重组率为１００％，条带主要分布在６００ ｂｐ—１．８ ｋｂ 范围内，平均插入片段约ｌ ｋｂ，文库质量较好，符合 建库要求。
将剩下的３管未扩增文库混合后共约３ ｍＬ，分 别涂在６０个直径１８ ｃｍ的大平板（ＬＢ＋ＡＭＰ ５０ ｍｇ／ｍＬ）上，每个平板约涂５０斗Ｌ；过夜培养１８～２０ ｈ后，加入５ ｍＬ ＬＢ液体培养基至每个平板，并将菌 落刮至溶液中。将所有收集的菌落倒入一个细颈瓶 中，充分混匀，一部分于一８０℃永久保存，一部分提 质粒用于后续的文库筛选。
ｃＤＮＡ的蛋白酶Ｋ消化、Ｓｆｉ Ｉ酶切和ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ一４００柱分级分离：蛋白酶Ｋ消化后加入７９ “Ｌ的去离子水，经过Ｓｆｉ Ｉ酶切处理后过柱分离，准 备１６个１．５ ｍＬ的离心管收集过柱产物。将收集到 的１６管产物，每管各取３斗Ｌ进行琼脂糖凝胶电泳 检测，根据电泳图，将出现弥散条带的４管合并成１ 管，用于与线性载体ＹＰｌ３连接。 １．２．４连接和转化大肠杆菌
酶０．５斗Ｌ，用去离子水补足总体积５斗Ｌ。１６℃过 夜，去盐后，将５¨Ｌ连接产物电转感受态ＤＨｌ０Ｂ ２５
斗Ｌ，电击条件２．０ ｋＶ，２００Ｑ，２５妒；然后转入含９７０ 肛Ｌ ＬＢ培养基的离心管中，置摇床上以３７℃、２２５
万方数据
李玲龙等：低温诱导东乡野生稻幼苗期叶片ｃＤＮＡ文库的构建和鉴定
·６ｌ·
摘要：从８℃低温诱导的东乡野生稻幼叶中提取总ＲＮＡ，以总ＲＮＡ为模板，利用ＳＭＡＲＴ技术合成第ｌ链，再经ＬＤ—ＰｃＲ扩增合
成第２链后，将获得的双链ｃＤＮＡ与双元表达载体ＹＰＩＪ３连接，重组质粒电转人大肠杆菌，成功构建了东乡野生稻ｃＤＮＡ文库。经 测定，原始文库滴度平均为４．４×ｌＯ ７ ｃｆⅣＩｌｌＬ，平均插入片段约１ ｋｂ，重组率为１００％，符合ｃＤＮＡ文库构建要求。为后续利用酵母功
用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的％ｚｏｌ按照其操作说明书 要求提取冷诱导的东乡野生稻叶片的总ＲＮＡ，并用 １％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总ＲＮＡ 质量，并把提取的ＲＮＡ做保温试验，以确保初始 ＲＮＡ质量达到建库的要求。以上所有操作严格按 照ＲＮＡ操作要求进行。
１．２．３ ｃＤＮＡ合成与纯化 单链ｃＤＮＡ的合成：取ｌ“Ｌ总ＲＮＡ（约１斗ｇ）
转／ｍｉｎ孵育１ ｈ。 １．２．５原始文库的滴度测定及重组率检测
电转产物孵育ｌ ｈ后，分别从３管（Ａ，Ｂ，Ｃ）中 各取ｌ“Ｌ培养物，稀释ｌ ０００倍，然后取ｌ¨Ｌ涂板 （ＬＢ＋ＡＭＰ ５０ ｍｇ／ｍＬ），过夜培养后，检查平板克隆 数，计算原始文库滴度（文库滴度＝克隆数×稀释 倍数×１ ０００）；同时挑单克隆培养后提取质粒，用 ｓｆｉ Ｉ酶切质粒，计算重组率和平均插入片段大小。 １．２．６文库的扩增
２．２提取的总ＲＮＡ的质量 经分光光度计检测，提取的东乡野生稻总ＲＮＡ
的ＯＤ２６０／ｏＤ２８０值为１．８５，分布在１．８—２．Ｏ之
万方数据
注：１为２００ ｂｐ ｍａｄ【ｅ。；２，３，４是合成的双链ｃＤＮＡｏ Ｎｏｔｅ：ｌｉ８２００ ｂｐ ｆ岫ｒｋｅ。；２，３，４ ａｒｅ ｄｓ ｃＤＮＡ．
图４合成的双链ｃＤＮＡ电泳结果
重点项目（２００６ＡＡｌｏｏｌ０１）；国家科技支撑计划项目 （２００７ＢＡＤ７７８００）；国家转基因新品种培育墓大专项 （２００８ｚ如８００ｌ—０４） 作者简介：李玲龙（１９８５一），男，湖南衡阳人，在读硕士生。电话： １５８７４９９６５２９；Ｅ—ｍｊｌ：ｘｉａｏｑｉａｏｔｉｔｏｕ＠ｙａｌｌ００．ｃｍ．ｃｎｏ ｝通讯作者。电话：０７３１—８２５５８７５８，８２８７２９５ｌ；Ｅ一Ⅱｌａｉｌ：ｍｌｃ肿＠ ｈｈｎ℃．卵．ｃｎ。
为模板，以ｃＤｓⅢ／３’ＰｃＲ和ｓＭＡＲＴⅣＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅ— ｏｔｉｄｅ为引物，在反转录酶的作用下反转录出ｃＤＮＡ 第１链。
第２链的合成采用Ａｄｖａｎｔａ曙ｅ ２ ＰｃＲ试剂盒，取 ２斗Ｌ第ｌ链合成产物通过ＬＤ—ＰｃＲ进行双链ｃＤ． ＮＡ的合成（反应程序：９５℃ｌ ｍｉｎ；２２个循环：９５℃
１５ ｓ，６８℃６ ｍｉｎ），反应结束后取５斗Ｌ样品在琼脂糖 凝胶上电泳检测。
注：ｌ为ｌ ｋｂｍａｒｋｅｒ；２一１７为分级分离后的ｃＤＮＡ产物。Ｎｏｔｅ：１ ｉ８ １ ｋｂ ｍａｒｋｅｒ：２一１７ ａｒｅ ｄｓ ｃＤＮＡ ｓｉ∞ｆｍｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．
图５ 双链ｃＤＮＡ经ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ一４００柱分级分离
Ｆ运５．ｄｓ ｃＤＮＡ ｓｉｚｅ ｆｈｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ一４００．
把ｐＤＮＲ—Ｌｉｂ载体（图１）用ＥｃｏＲ Ｉ和ＨｉｎｄⅢ 双酶切后，回收含插入片段和ｓ６ Ｉ双酶切位点（Ｓｆｉ Ｉ Ａ和Ｓ｛ｉ Ｉ Ｂ）的短片段Ａ（６００ ｂｐ左右）；把Ｙｅｐ— ＧＡＰｌｌ２载体（图１）用ＥｃｏＲ Ｉ和ＨｉｎｄⅢ双酶切后， 回收长片段Ｂ（约６ ｋｂ）；然后用Ｔ４连接酶把回收的
收稿日期：２００９一０９一０４ 基金项目：基金项目：科技部９７３项目（２００７ｃＢｌ０９００７）；科技部８６３
注：ｌ～１６为文库重组子蛳Ｉ酶切产物；１７为ｌ ｋｂ ｍｒｋｅ‘；１８为２００ ｂｐ ｍａｒｋｅｒｏ Ｎｏｔｅ：１～１６ ａｒｅ”ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｂｙ ｓ６ Ｉ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；１７ ｉ￥ｌ ｋｂ
注：ｌ为１ ｋｂ ｍａｒｋｅｆ；２为ＹＰＬ３质粒；３为蛳Ｉ酶切ＹＰｌ３产物；４为 ２００ ｂｐ ｍａｒｋｅｒ。Ｎｏｔｅ．１ ｉｓ ｔｈｅ １ ｋｂ ｍａｒＩ【ｅ。；２ ｉｓ ｔｈｅ ｎｅｗ Ｖｅｃｔｏｒ ＹＰＬ３；３ ｃｕｔ ｂｙ ｓ６Ｉ；４ｉＢｔｈｅ ２００ｂｐｍａｒｋｅｒ．
图２新构建载体ＹＰＬ３的Ｓｆｉ Ｉ酶切产物鉴定结果 Ｆｉｇ ２．Ｓｆｉ Ｉ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗ ｖｅｃｔｏｒ ＹＰＬ３．
为了得到较长ｃＤＮＡ片段，去掉ｃＤＮＡ双链中 的小片段，采用ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ一４００柱进行了片段
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杂交水稻（ｍ田脚Ｄ彤ＣＥ），２０１０，２５（２） ２０１０年３月（Ｍａｒ．，２０１０）
大小分级分离（图５）。从图５可见，第９，１０，１１，１２ 号泳道出现明显弥散条带，将９，１０，１１，１２号泳道对 应的４管产物收集合并成ｌ管，以供连接使用。
能互补技术筛选东乡野生稻有利基因奠定了基础。
关键词：东乡野生稻；低温诱导；ｃＤＮＡ文库构建；ＳＭＡＲＴ技术
中图分类号：Ｓ５１１．Ｏｌ；Ｑ７５
文献标识码：Ａ
文章编号：１００５—３９５６１２叭Ｏ）０２一００５９一０４
东乡野生稻是迄今为止世界上分布最北的野生 稻…，能在一１２．８一Ｏ℃低温条件下安全越冬悼Ｊ，具 有众多的优良性状和丰富的遗传多样性。目前已鉴 定出的有利基因有：胞质雄性不育、耐寒、耐旱【３ Ｊ、 耐贫瘠、广亲和性、高产、抗矮缩病、抗黄矮病、抗稻 瘟病、抗螟虫及“野败”恢复基因等。为深入挖掘东 乡野生稻潜在的基因资源，笔者取低温诱导的东乡 野生稻幼苗叶片，采用先进的ＳＭＡＲＴ技术构建了 全长ｃＤＮＡ文库。ｓＭＡＲＴ构建文库技术是目前应 用较广泛的一种建库技术，主要原理是利用反转录 酶、末端转移酶活性、锚定引物和内切酶Ｓｆｉ Ｉ等特 性构建全长ｃＤＮＡ文库。该方法由于所需材料少 （０．０２５—０．５斗ｇ ｍＲＮＡ或者０．０５一１．０¨ｇ总 ＲＮＡ），实验过程快速、简单和全长率较高等优点而 应用广泛，本研究将该技术引进野生稻基因利用领 域，为进一步克隆东乡野生稻功能基因开辟一条新 的途径。
将ｃＤＮＡ片段连接到线性ＹＰｌ３载体。为了探 索最佳的连接效果，采用不同的ｃＤＮＡ用量与ＹＰＬ３ 线性载体进行３个平行的连接反应：Ａ管含ｃＤＮＡ
Ｏ．５斗Ｌ，Ｂ管含ｃＤＮＡ １．０斗Ｌ，Ｃ管含ｃＤＮＡ １．５斗Ｌ， 各管其它试剂用量分别为ＹＰＬ３线性载体１．０斗Ｌ，
１０倍连接缓冲液０．５灿，Ａ，Ｉ．Ｐ ０．５此，Ｔ４ＤＮＡ连接
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杂交水稻（ｍ侣肋尺，阳），２０１０，２５（２） ２０１０年３月（Ｍａｒ．，２０１０）
图ｌ ＹＰＬ３载体构建流程 Ｆｉｇ １． Ｃｏｎｓｔｍｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ ＹＰＬ３ Ｖｅｃｔｏｒ．
短片段Ａ和长片段Ｂ于１６℃过夜连接，将连接产物 电转人大肠杆菌ＤＨｌ０Ｂ，铺平板（ＬＢ＋ＡＭＰ），挑单 克隆摇菌，提取质粒并用蛳Ｉ酶切鉴定并保存，新 载体命名为ＹＰＬ３（图１）。将新载体用ｓｆｉ Ｉ酶切后 回收并纯化作为文库构建的线性载体备用。 １．２．２东乡野生稻总ＲＮＡ的提取及质量检测
６０ｎ．
图３ 东乡野生稻叶片总ＲＮＡ电泳结果
Ｆｉｇ ３．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆ而ｍ ｌｅａＶｅｓ ｏｆ Ｄｏｎｇ）【ｉａｎｇ ｗｉｌｄ ｒｉｃｅ．
２．３双链ｃＤＮＡ的合成与纯化 取提取的总ＲＮＡ进行反转录和ＬＤ—ＰＣＲ反应
后合成了双链ｃＤＮＡ，经琼脂糖凝胶电泳检测，双链 ｃＤＮＡ片段主要弥散带集中在６００ ｂｐ～４ ｋｂ范围 （图４），说明双链ｃＤＮＡ合成质量高，效果很好，可 以满足全长ｃＤＮＡ文库构建的需求。
杂交水稻（ｍ倡尺仍尺，ｃ层），２０１０，２５（２）：５９—６２
·５９·
低温诱导东乡野生稻幼苗期叶片 ｃＤＮＡ文库的构建和鉴定
李玲龙”，邢俊杰１’２…，崔玲玲１’２，韩小霞１’２，阳志刚１’２，李丁Ｌ２，谢灵灵１，一，曹孟良１’２’３’‘
（１．中南大学研究生院隆平分院，湖南长沙４ｌＯｌ２５；２．长沙杂交水稻基因工程技术研究中心，湖南长沙４１０２０５； ３．国家杂交水稻工程技术研究中心，湖南长沙４１０１２５）
２结果与分析
２．１双元表达载体ＹＰＤ的构建 新构建的载体ＹＰＬ３的蛆Ｉ酶切产物鉴定结果
见图２，载体大小约６ ｋｂ，插入片段约６００ ｂｐ，载体 ＹＰＬ３构建正确。
间。从电泳结果（图３）看，１８Ｓ和２８Ｓ条带清晰，保 温试验前后条带没有变化，说明所提总ＲＮＡ的纯度 和完整性好，可用于文库构建。
注：１为１ ｋｂ ｍａｒｋｅｒ；２为保温前的总ＲＮＡ；３为保温后的总ＲＮＡ。 Ｎｏｃｅ：ｌ ｉｓ ｌ ｋｂ ｍａｒｋｅ‘；２ ｉｓ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ Ｄｏｎｇｘｉａｎｇ ｗｉｌｄ ｒｉｃｅ ｂｅｆｏ他ｈｅａｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ；３ ｉｓ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ Ｄｏｎ铲ｉ帅ｇ ｗｉｌｄ ｒｊｃｅ ａｎｅｒ ｈｅａｔ ｐＩ．ｅ鸵ｎ，ａ－
％ｚｏｌ和感受态细胞ＤＨｌｏＢ购自Ｉｎｖｉ咖ｇｅｎ公
万ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ数据
司，Ｃｒｅａｔｏｒ下Ｍ ｓＭＡＲＴＴＭ ｃＤＮＡ文库构建试剂盒和Ａｄ． ｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ试剂盒购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司，ＱＩＡＥＸⅡ 胶回收试剂盒购自ＱＩＡＧＥＮ公司，Ｓｆｉ Ｉ酶购自宝生 物公司 １．１．３ 引 物
合成ｃＤＮＡ第１链的引物为ｃＤｓⅢ／３ ７ＰｃＲ引 物：５’一ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ—ｄ （Ｔ）３０Ｎ—ｌＮ一３，（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，或Ｔ；Ｎ一１＝Ａ，Ｇ，或Ｃ， ｄ（Ｔ）加代表３０个多聚Ｔ）；合成第ｌ链的锚定引物 为：５，－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴ— ＡｃＧＧＣｃＧＧＧ一３’；合成ｃＤＮＡ第２链的引物为５ ７ ＰＣＲ弓Ｉ物：５ ＬＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－３’。 １．２试验方法 １．２．１双元表达载体ＹＰＬ３的构建
１材料和方法
１．１ 供试材料 １．１．１ 东乡野生稻
将东乡野生稻的多年生宿根移栽到实验室温室 培养，待生长至第１片幼叶长约３０ ｃｍ时，移人冰箱 ８℃低温诱导（冰箱门为透明玻璃，能提供自然光 照）３ ｄ后，剪取叶片，每份约０．２ ｇ，用锡箔纸包装， 置液氮中速冻，然后一８０℃保存备用。 １．１．２主要试剂和酶
２．４文库的构建与质量检测 将Ａ、Ｂ、Ｃ ３管平行的连接产物去盐纯化后分
别电转到感受态大肠杆菌中，成功构建了３个原始 ｃＤＮＡ文库。经测定，３个文库的滴度分别为５．２× １０７，７．４×１０。７和７×１０６ ｃｆ∥ｍＬ，平均滴度为４．４× １０７ ｃｆ∥ｍＬ。挑取１６个单克隆进行重组率检测，结 果（图６）显示，１６个样品中均有条带出现，文库的 重组率为１００％，条带主要分布在６００ ｂｐ—１．８ ｋｂ 范围内，平均插入片段约ｌ ｋｂ，文库质量较好，符合 建库要求。
将剩下的３管未扩增文库混合后共约３ ｍＬ，分 别涂在６０个直径１８ ｃｍ的大平板（ＬＢ＋ＡＭＰ ５０ ｍｇ／ｍＬ）上，每个平板约涂５０斗Ｌ；过夜培养１８～２０ ｈ后，加入５ ｍＬ ＬＢ液体培养基至每个平板，并将菌 落刮至溶液中。将所有收集的菌落倒入一个细颈瓶 中，充分混匀，一部分于一８０℃永久保存，一部分提 质粒用于后续的文库筛选。
ｃＤＮＡ的蛋白酶Ｋ消化、Ｓｆｉ Ｉ酶切和ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ一４００柱分级分离：蛋白酶Ｋ消化后加入７９ “Ｌ的去离子水，经过Ｓｆｉ Ｉ酶切处理后过柱分离，准 备１６个１．５ ｍＬ的离心管收集过柱产物。将收集到 的１６管产物，每管各取３斗Ｌ进行琼脂糖凝胶电泳 检测，根据电泳图，将出现弥散条带的４管合并成１ 管，用于与线性载体ＹＰｌ３连接。 １．２．４连接和转化大肠杆菌
酶０．５斗Ｌ，用去离子水补足总体积５斗Ｌ。１６℃过 夜，去盐后，将５¨Ｌ连接产物电转感受态ＤＨｌ０Ｂ ２５
斗Ｌ，电击条件２．０ ｋＶ，２００Ｑ，２５妒；然后转入含９７０ 肛Ｌ ＬＢ培养基的离心管中，置摇床上以３７℃、２２５
万方数据
李玲龙等：低温诱导东乡野生稻幼苗期叶片ｃＤＮＡ文库的构建和鉴定
·６ｌ·
摘要：从８℃低温诱导的东乡野生稻幼叶中提取总ＲＮＡ，以总ＲＮＡ为模板，利用ＳＭＡＲＴ技术合成第ｌ链，再经ＬＤ—ＰｃＲ扩增合
成第２链后，将获得的双链ｃＤＮＡ与双元表达载体ＹＰＩＪ３连接，重组质粒电转人大肠杆菌，成功构建了东乡野生稻ｃＤＮＡ文库。经 测定，原始文库滴度平均为４．４×ｌＯ ７ ｃｆⅣＩｌｌＬ，平均插入片段约１ ｋｂ，重组率为１００％，符合ｃＤＮＡ文库构建要求。为后续利用酵母功
用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的％ｚｏｌ按照其操作说明书 要求提取冷诱导的东乡野生稻叶片的总ＲＮＡ，并用 １％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总ＲＮＡ 质量，并把提取的ＲＮＡ做保温试验，以确保初始 ＲＮＡ质量达到建库的要求。以上所有操作严格按 照ＲＮＡ操作要求进行。
１．２．３ ｃＤＮＡ合成与纯化 单链ｃＤＮＡ的合成：取ｌ“Ｌ总ＲＮＡ（约１斗ｇ）
转／ｍｉｎ孵育１ ｈ。 １．２．５原始文库的滴度测定及重组率检测
电转产物孵育ｌ ｈ后，分别从３管（Ａ，Ｂ，Ｃ）中 各取ｌ“Ｌ培养物，稀释ｌ ０００倍，然后取ｌ¨Ｌ涂板 （ＬＢ＋ＡＭＰ ５０ ｍｇ／ｍＬ），过夜培养后，检查平板克隆 数，计算原始文库滴度（文库滴度＝克隆数×稀释 倍数×１ ０００）；同时挑单克隆培养后提取质粒，用 ｓｆｉ Ｉ酶切质粒，计算重组率和平均插入片段大小。 １．２．６文库的扩增
２．２提取的总ＲＮＡ的质量 经分光光度计检测，提取的东乡野生稻总ＲＮＡ
的ＯＤ２６０／ｏＤ２８０值为１．８５，分布在１．８—２．Ｏ之
万方数据
注：１为２００ ｂｐ ｍａｄ【ｅ。；２，３，４是合成的双链ｃＤＮＡｏ Ｎｏｔｅ：ｌｉ８２００ ｂｐ ｆ岫ｒｋｅ。；２，３，４ ａｒｅ ｄｓ ｃＤＮＡ．
图４合成的双链ｃＤＮＡ电泳结果
重点项目（２００６ＡＡｌｏｏｌ０１）；国家科技支撑计划项目 （２００７ＢＡＤ７７８００）；国家转基因新品种培育墓大专项 （２００８ｚ如８００ｌ—０４） 作者简介：李玲龙（１９８５一），男，湖南衡阳人，在读硕士生。电话： １５８７４９９６５２９；Ｅ—ｍｊｌ：ｘｉａｏｑｉａｏｔｉｔｏｕ＠ｙａｌｌ００．ｃｍ．ｃｎｏ ｝通讯作者。电话：０７３１—８２５５８７５８，８２８７２９５ｌ；Ｅ一Ⅱｌａｉｌ：ｍｌｃ肿＠ ｈｈｎ℃．卵．ｃｎ。
为模板，以ｃＤｓⅢ／３’ＰｃＲ和ｓＭＡＲＴⅣＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅ— ｏｔｉｄｅ为引物，在反转录酶的作用下反转录出ｃＤＮＡ 第１链。
第２链的合成采用Ａｄｖａｎｔａ曙ｅ ２ ＰｃＲ试剂盒，取 ２斗Ｌ第ｌ链合成产物通过ＬＤ—ＰｃＲ进行双链ｃＤ． ＮＡ的合成（反应程序：９５℃ｌ ｍｉｎ；２２个循环：９５℃
１５ ｓ，６８℃６ ｍｉｎ），反应结束后取５斗Ｌ样品在琼脂糖 凝胶上电泳检测。
注：ｌ为ｌ ｋｂｍａｒｋｅｒ；２一１７为分级分离后的ｃＤＮＡ产物。Ｎｏｔｅ：１ ｉ８ １ ｋｂ ｍａｒｋｅｒ：２一１７ ａｒｅ ｄｓ ｃＤＮＡ ｓｉ∞ｆｍｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．
图５ 双链ｃＤＮＡ经ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ一４００柱分级分离
Ｆ运５．ｄｓ ｃＤＮＡ ｓｉｚｅ ｆｈｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ一４００．
把ｐＤＮＲ—Ｌｉｂ载体（图１）用ＥｃｏＲ Ｉ和ＨｉｎｄⅢ 双酶切后，回收含插入片段和ｓ６ Ｉ双酶切位点（Ｓｆｉ Ｉ Ａ和Ｓ｛ｉ Ｉ Ｂ）的短片段Ａ（６００ ｂｐ左右）；把Ｙｅｐ— ＧＡＰｌｌ２载体（图１）用ＥｃｏＲ Ｉ和ＨｉｎｄⅢ双酶切后， 回收长片段Ｂ（约６ ｋｂ）；然后用Ｔ４连接酶把回收的
收稿日期：２００９一０９一０４ 基金项目：基金项目：科技部９７３项目（２００７ｃＢｌ０９００７）；科技部８６３
注：ｌ～１６为文库重组子蛳Ｉ酶切产物；１７为ｌ ｋｂ ｍｒｋｅ‘；１８为２００ ｂｐ ｍａｒｋｅｒｏ Ｎｏｔｅ：１～１６ ａｒｅ”ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｂｙ ｓ６ Ｉ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；１７ ｉ￥ｌ ｋｂ
注：ｌ为１ ｋｂ ｍａｒｋｅｆ；２为ＹＰＬ３质粒；３为蛳Ｉ酶切ＹＰｌ３产物；４为 ２００ ｂｐ ｍａｒｋｅｒ。Ｎｏｔｅ．１ ｉｓ ｔｈｅ １ ｋｂ ｍａｒＩ【ｅ。；２ ｉｓ ｔｈｅ ｎｅｗ Ｖｅｃｔｏｒ ＹＰＬ３；３ ｃｕｔ ｂｙ ｓ６Ｉ；４ｉＢｔｈｅ ２００ｂｐｍａｒｋｅｒ．
图２新构建载体ＹＰＬ３的Ｓｆｉ Ｉ酶切产物鉴定结果 Ｆｉｇ ２．Ｓｆｉ Ｉ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗ ｖｅｃｔｏｒ ＹＰＬ３．