细胞分离纯化

1 小鼠腹腔巨噬细胞

雌性小鼠脊椎脱臼处死, 75% 酒精消毒3 min; 用预冷的Hanks液（不含钙镁离子）洗出腹腔细胞, 1 000 r/m in 离心5min , 调整细胞浓度为每毫升1×106个, 置细胞瓶中培养4 h, 弃去培养液,，留下贴壁细胞，即为巨噬细胞，PBS洗涤两次, 加入含10%小牛血清的1640培养基。

参考文献

【1】The immune response of peritoneal macrophages due to exposure to inorganic lead in the house mouse Mus musculus

【2】A study on the immune receptors for polysaccharides from the roots of Astragalus membranaceus, a Chinese medicinal herb

【3】海洋真菌多糖YCP结合的免疫细胞类型的体外筛选

2 小鼠脾巨噬细胞

通过研磨法获取脾细胞, 将脾细胞重悬在1mL细胞培养基内，小心加于2mL的淋巴细胞分层液面上, 2000r/min密度梯度离心20min, 小心吸出第二层细胞, 放入含Hanks液15mL 的试管中充分混匀后, 离心弃上清, 加入含10%小牛血清的1640 培养基6mL, 调整细胞浓度为每毫升5×106个, 37℃、5% CO2培养瓶中培养2h, 洗去非贴壁细胞, 获得纯化的脾巨噬细胞。

主要试剂：淋巴细胞分层液

参考文献

【3】海洋真菌多糖YCP结合的免疫细胞类型的体外筛选

【4】Effects of repeated social stress on leukocyte distribution in bone marrow, peripheral blood and spleen

【5】Differential response of splenic monocytes and DC from cattle to microbial stimulation with Mycobacterium bovis BCG and Babesia bovis merozoites

【6】Flow cytometric identification of murine neutrophils and monocytes

【7】CHARACTERIZATION AND REGULATION OF RB6-8C5 ANTIGEN EXPRESSION ON MURINE BONE MARROW CELLS

3脾B、T细胞

研磨法获取脾细胞，红细胞裂解液去除红细胞。通过生物素化的抗CD4, CD8（T细胞）, GR-1（MΦ）和CD11c（DCs）抗体和链霉素化磁珠M-280分选出脾B细胞，通过生物素化的抗B220（B细胞）, GR-1和CD11c 分选出脾T细胞。

参考文献

【8】Induction of dendritic cell maturation by β-glucan isolated from Sparassis crispa

【9】Rgs1 and Gnai2 Regulate the Entrance of B Lymphocytes into Lymph Nodes and B Cell Motility within Lymph Node Follicles

【10】Abnormal B-Cell Responses to Chemokines, Disturbed Plasma Cell Localizationl

4大鼠肝Kupffer细胞

非实质肝细胞混悬液（NPC）的制备：选用雄性的Spraqae-Dawley清洁级大鼠, 8～12周龄, 体重200～300 g。10%的氯胺酮麻醉, 腹腔内注射。腹部剃毛, 消毒、贴膜后固定于操作台上。切开腹壁、进入腹腔, 分别显露门静脉及下腔静脉, 于下腔静脉内注入1 000单位/ ml 的肝素1 ml。游离门静脉, 结扎远端, 剪开血管, 置入直径4 mm 的硅胶管, 深度不宜超过肝门, 供灌注用。同样处理下腔静脉, 置入2mm硅胶管, 供引流用, 同时阻断上腔静脉。灌注冲洗: 用预热37℃的D-Hanks 液灌注, 采用电子蠕动泵控制流速为40 ml/ min, 快速灌注冲洗5min, 以流出液变清和肝表面呈黄白色为标准。胶原酶原位循环灌注消化: 冲洗完成

后, 取原位灌注消化液100 ml, 预热37℃。电子蠕动泵灌注, 调整流速为20 ml/ min, 从门脉插管内注入, 于下腔静脉插管内流出, 并收集100 ml 于烧杯内, 循环大约3～4次。待肝变软、塌陷, 弹性消失, 以棉签压迫凹陷不易恢复和肝被膜下出现空泡时, 表明灌注消化完全, 时间约15～20 min。将摘下, 浸入预热37℃的肝细胞消化液中, 去除肝被膜, 100 目不锈钢筛网滤过, 获得肝组织细胞悬液。将细胞悬液移入250 ml 的锥形瓶中, 放入37℃的水箱内, 水浴震荡消化1 h, 绝大多数肝细胞被破坏, 获得非实质肝细胞混悬液( NPC) 。

Kupffer细胞悬液制备：通过胶原酶二步灌注法制备肝细胞, 细胞悬液离心去上清, 悬浮于GBSS溶液40 mL中。取离心管若干支, 仔细将Nycodenz梯度液铺层: 底层为16% Nycodenz、密度1.080; 中层为10.8% Nycodenz、密度1.058; 顶层为肝细胞的GBSS悬液(梯度液与细胞悬液合适的比例为2：1~ 3：1)。放入悬垂式冷冻离心机, 1 000 r /min离心30 min, 吸取1.058和1.080 密度界面上的Kupffer细胞, 加入GBSS至100mL, 离心, 最终细胞团悬浮于GBSS 液中4mL。离心弃去GBSS液, 加入含20%小牛血清的DMEM高糖培养基, 调整细胞浓度为每毫升1.5×106个, 接种于培养瓶中, 置37 ℃、5% CO2 培养箱内, 孵育30 ~ 60 min后取出, 洗去非贴壁细胞, 获得纯化的大鼠肝Kupffer细胞。

参考文献

【11】Transforming growth factor beta mediates hepatocyte apoptosis through Smad3 generation of reactive oxygen species

【12】大鼠肝Kupffer 细胞分离培养及鉴定

5 人外周血单个核细胞

5.1外周血单个核细胞(peripheral mononuclear cells，PMNC)包括淋巴细胞和单核细胞(monocyte)。单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，红细胞和多核白细胞的比重在1.092 左右，单个核细胞的比重为1.075-1.090，血小板为1.030-1.035。因此利用一种介于1.075-1.092之间而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种血细胞与单个核细胞分离。

聚蔗糖-泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，商品名为Ficoll，分离人外周血淋巴细胞以密度为1.077±0.001 的分层液最佳，因为人的红细胞的密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1．076～1．090之间。常规的单个核细胞分离液由2份6％聚蔗糖蒸馏水溶液+1份34%泛影葡胺生理盐水溶液组成，其比重为1.077±0.002.

Ficoll 分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素抗凝全血以Hanks 液或PBS 液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。由于红细胞和粒细胞比重大于分层液，同时因红细胞在Ficoll 液中凝聚成串而沉于管底，血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面之中，呈白膜状为白膜层。吸取该层细胞经洗涤离心重悬即为单个核细胞。本法分离的单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％。

5.2淋巴细胞

根据密度离心分离法获得的淋巴细胞主要混合在单个核细胞悬液中，由于淋巴细胞在数量上占单个核细胞的大多数，因此，单个核细胞有时也可以大致地代表淋巴细胞直接用于某些实验，但严格地讲，采用上述方法获得的单个核细胞需去除单核细胞才能较为准确地代表淋巴细胞用于实验。去除单核细胞的主要方法有以下几种。

(一)贴壁黏附法

利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶中，至37℃温箱静置1 h，单核细胞和粒细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细