保健食品安全性毒理学评价

第二阶段：遗传毒性试验，30天喂养试验，传统致畸试验
遗传毒性试验：原核细胞和真核细胞，体内试验和体外试验相结合 Ames或基因突变试验；微核试验或染色体畸变试验；精子畸变试验等
第三阶段：亚慢性毒性试验
90天喂养试验、繁殖试验、代谢试验
第四阶段：慢性毒性试验（包括致癌试验）
选择毒理学试验的基本原则
2.一般无需进行毒性试验的原料或成分 属于普通食品和卫生部规定的药食同源的物质： 采用传统的工艺及食用方式 水提取物，常规服用量，无不安全性报道 来源、工艺和质量符合国家要求的营养强化剂 或营养素补充剂
保健食品安全性毒理学 检验及评价
主 要 内 容

ห้องสมุดไป่ตู้
检验评价依据 审评基本要求 选择毒理学试验的基本原则 实验动物的选择


样品的预处理原则
毒理学试验项目要点介绍


毒理学安全性评价时应考虑的问题
审评结论的判定
毒性及功能检验评价依据
1996年3月卫生部《保健食品的管理方法》
保健食品的标准、功能评价、审批程序和监督管理办法
急性联合毒性：两种或两种以上的受试物，可能发生拮抗、相
加或协同的联合方式，可以根据一定的公式计算和判定标准来 确定这三种不同的作用。
急性经口毒性试验
时间周期：一般为3周
3-5天，大、小鼠适应期
7-14天，染毒及实验观察期 发生动物死亡时，应进行大体解剖 观察和评价指标： 毒性反应症状：各器官系统的反常表现（中枢、自主神经、呼 吸、心血管、胃肠、生殖泌尿系统、皮毛、粘膜等）及体重变 化 死亡情况：死亡的时间、数量、性别、表现等。
哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验
时间周期：一般为3周
3-5天适应期
小鼠或大鼠经口染毒2-4次，每次间隔24h，在 末次染毒18-24h进行取材（取材前2-4h，腹腔注射秋水 仙素）。 取股骨，收集骨髓，制片，染色，镜检 剂量设计：同骨髓细胞微核试验
哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验
观察及评价指标：
每只动物分析100个中期相细胞 ，每个剂量组不少于 1000个。记录染色体数目及结构的改变。 结果评价： 受试物组与对照组染色体畸变率相比，增高呈剂量反应 关系并有统计学意义，试验结果为阳性。
常用的介质有：蒸馏水、食用植物油、淀粉、明胶及羧甲基 纤维素等。
2.液体类
受试物浓缩倍数应符合试验要求。 浓缩方法不应破坏其有效成份，常用的有60℃～70℃减压或 常压蒸发、冷冻干燥。 按工艺要求。
样品的预处理原则
3.袋泡茶类
处理方法与产品推荐饮用方法相同
推荐用：80℃--90℃ 常压用水浸泡30min
骨髓细胞微核试验
目的：
检测整体动物体内骨髓嗜多染红细胞微核发生率，以评 价受试物致突变的可能性。 原理： 微核是在细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞 形成细胞核时，仍然留在细胞质中的色单体或染色体的 无着丝点断片 。末期之后，单独形成一个或几个规则的 次核，被包含在细胞胞质内，因比主核小，故称为微核。
选择毒理学试验的基本原则
在已批准的保健食品中使用过，或卫生部已批准为 新资源食品的原料，符合以下情况的仍按新原料进行管 理： 未列入国家食品药品监督管理局公布的可用于保健食 品的物品名单；
尚未列入卫生部公布或批准的食品新资源或新资源食 品名单内；
卫生部已批准为食品新资源或新资源食品，但保健食 品注册申请人与食品新资源或新资源食品生产批件中载 明的申报单位不一致。
一、二阶段试验结果与国外产品不一致的
国外少数国家或地区食用的原料或成分
水提取物，大于常规服用量
用水提以外的其它常用工艺生产的，大于常规用量
选择毒理学试验的基本原则
6.需进行一至四阶段毒性试验的原料和成分
国内外均无食用先例
7.敏感指标及敏感试验的保健食品
不同食用人群和（或）不同功能的保健食品
多种原料的配方产品，应提供配方
配方产品，必要时还应提供各组分，功效成分的 物理和化学性质及其检测报告 提供原料来源、生产工艺、人的可能摄入量。使 用说明书等有关资料 受试物应符合既定配方和生产工艺的规格化产品
实验动物的选择及给样量
1.根据各项实验的具体要求，合理选择实验动物
选择毒理学试验的基本原则
新原料安全性毒理学试验项目的选择
①无食用史 ②局部地区有食用史 需做四阶段试验 需做三阶段试验
需做第四阶段试验
其中 ，100倍<摄入量<300倍
③ 有食用史
经评价后
需做二阶段试验
下一阶段试验
④ 广泛食用的原料
二阶段试验
（食用史包括地区、年代、人群、食用量、频率等情况）
选择毒理学试验的基本原则
鼠伤寒沙门氏菌（Ames）试验
观察及评价指标： 各受试物组及三个对照组的四种菌株（TA97a，TA98， TA100和TA102）分别在加和不加S9情况下的菌落计数。 结果评价（掺入法）： 受试物组回变菌落数增加一倍以上（即回变菌落数 ≥2×未处理对照组数），并有剂量反应关系或有可重复 的阳性反应，即可判试验阳性。
新原料安全性毒理学试验项目的选择
⑤ 已知化学物: ⑤-1 可只做二阶段实验的包括 已有权威机构进行系统的毒理学安全性评价 有资料证明所用原料与其一致 ⑤-2 如试验结果与权威机构进行的评价不一致， 需进入下阶段的试验
⑥ 有新原料的保健食品: 根据试验结果综合分析。
对受试保健食品的要求
单一已知化学成分，应提供物理和化学性质
7.以食品为载体的受试物
（1）有营养价值：按设计量进行饲料的营养成份调整，提供详细的说 明。 （2）大豆蛋白、乳清蛋白 如质量、工艺等符合食品标准和安全要求，允许去除。
如仅以该原料生产的，可申请免做毒理学试验。
毒理学试验项目要点介绍
急性经口毒性试验
鼠伤寒沙门氏菌（Ames）试验
骨髓细胞微核试验
极毒 剧毒 中等毒 低毒 实际无毒 无毒
急性经口毒性试验
试验结果的判定：
1. LD50＜人可能摄入量的100倍，放弃；反之继续下 一步试验。 2. LD50≥10g/kgbw或按最大耐受量染毒而未出现动 物死亡的，可继续下一步试验。
鼠伤寒沙门氏菌（Ames）试验
目的：检测受试物的诱变性，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可 能性。 时间周期：一般为2周
常用大鼠和小鼠，品系不限，推荐使用近交系。
2.动物应符合《实验动物管理条例》
清洁级或清洁级以上
动物合格证号及动物实验室合格证号
3.灌胃量
大鼠：10 ml/kg•BW（若以水为溶剂，推荐 20 ml/kg•BW） 小鼠：20ml/kg•BW
样品的预处理原则
1.介质的选择
应选择适合于受试动物的溶剂、乳化剂、助悬剂，要求无毒、 与受试物不发生反应、稳定性好。
1996年7月GB15193《食品安全性毒理学评价程序和方法》 卫生部《保健食品功能学评价程序和检验方法》
仅包含了12项功能检验及评价方法
2001年7月 卫生部《保健食品功能学评价程序和检验方法》
可受理和评价的功能调整到31项
2003年2月卫生部《保健食品检验与评价技术规范》
将功能学、毒理学、功效成分及卫生指标检验评价方法三者合一
审评的基本要求
1. 配方 原（辅）料、用量、理化性质
2. 剂量
食用方法及用量
3. 工艺
规格化产品 4. 批号 注意批号是否一致,益生菌、奶制品等保质期短的除外 符合配方、工艺、质量标准
选择毒理学试验的基本原则
1. 毒理学评价的四个阶段
第一阶段：急性毒性试验
经口急性毒性试验：LD50，联合急性毒性，一次最大耐受量试验
骨髓细胞微核试验
时间周期：一般为2周 3-5天适应期 小鼠经口染毒，30h给受试物法 取胸骨或股骨，收集骨髓，涂片，染色，镜检
剂量设计：至少设置3个剂量，最高剂量组为动物出现严重中 毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量。低剂量组应不出现毒 性反应。一般取LD50的1/2、1/4、1/8作为三个剂量。当受试 物的LD50≥10g/kg.bw时，最高剂量通常采用10g/kg.bw。同 时设阳性对照组和溶剂对照组。
水量为受试物的10倍，提取2次，2次提取液合并浓缩至 所需浓度 标明该浓缩液与受试物的比例
样品的预处理原则
4.含乙醇类
（1）不需浓缩的受试物
乙醇浓度<15％ 乙醇浓度>15％ （2）需浓缩的受试物 乙醇浓度<15％ 乙醇浓度>15％ 浓缩后调至原乙醇浓度 浓缩后调至15％乙醇浓度 直接进行试验 乙醇浓度应调至15％
在进行乙醇浓度调整时必须用原酒基
样品的预处理原则
5.膨胀系数较高的受试物
选择可溶性介质 给受试物的方法：灌胃 其最高浓度最大灌胃量时达不到人体推荐量的100倍， 按实际达到的倍数 标明受试物的膨胀系数
样品的预处理原则
6.益生菌等微生物类保健食品
在进行 Ames试验或体外细胞试验时需将受试物灭活。 需浓缩的应采用低温干燥法或由企业提供所需浓度的受试物（附方 法、技术参数）。
选择毒理学试验的基本原则
3. 需进行一阶段和三项致突变毒性试验的原料或成分
属于普通食品和卫生部规定的药食同源的物质且用水 提以外的其它常用工艺生产的： （1）服用量与常规用量相同 急性毒性、三项致突变试验 （2）服用量大于常规用量 还需加做30天喂养试验，必要时进行传统致畸试 验和第三阶段毒性试验
小鼠精子畸形试验
目的：
检测整体动物体内精子畸形发生率，以评价受试物对体 内生殖细胞的致突变作用。
原理： 小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染 色体及X、Y性染色体基因决定精子形态。精子的畸形主 要是指形态的异常，已知精子的畸形是决定精子形成的 基因发生突变的结果。因此形态的改变提示有关基因及 其蛋白产物的改变。
大体尸检结果：如果发生死亡动物
急性毒性（LD50）剂量分级表
级 别 大鼠口服LD50， mg/kg <1 1-50 51-500 501-5000 5001-15000 >15000 相当于人的致死量 mg/kg 稍尝 500-4000 4000-30000 30000-250000 250000-500000 >500000 g/人 0.05 0.5 5 50 500 2500
第一周，鼠伤寒沙门氏菌种、试剂、培养基准备
第二周，染毒，培养48h，读平板，菌落计数 剂量设计：决定受试物最高剂量的因素是对细菌的毒性及其溶解度。 最低剂量为0.2ug/皿；最高剂量为5mg/皿，或最大溶解剂量，最大 饱和剂量以及最小毒性剂量。可设五个剂量组，组间距不超过 5倍。
同时设：阳性对照组，溶剂对照组和未处理对照组。
选择毒理学试验的基本原则
4.需进行一、二阶段毒性试验的原料或成分
文献显示无危害，人群长期食用；
具有国际性毒理学评价结果的已知的化学物质，产 品质量规格与国外产品一致；
国外广泛食用且能提供安全性评价资料； 卫生部规定允许使用的动植物及其提取物或微生物。
选择毒理学试验的基本原则
5.需进行一至三阶段毒性试验的情况：
哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验
小鼠精子畸形试验
小鼠睾丸染色体畸变试验
30天喂养试验
急性经口毒性试验
目的：测定LD50，毒性分级。了解毒性强度、性质和可能的靶 器官，为进一步的毒性试验提供剂量和观察指标的选择依据。 原理：
急性毒性：经口一次性、24h内多次给予，短时间内的毒性反
应。致死剂量通常用半数致死剂量LD50表示。
骨髓细胞微核试验
观察及评价指标：
每只动物计数1000个嗜多染红细胞 ，记录含有微核的细 胞数，并计算微核千分率。观察嗜多染红细胞与成熟红 细胞的比例。
结果评价： 受试物组与对照组微核率相比，增高呈剂量反应关系并 有统计学意义，试验结果为阳性。
哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验
目的：检测受试物对整体动物骨髓细胞染色体畸变的致 突变性，以评价其致突变的可能性。 原理：当受试物作用于细胞周期G1期和S期时，可诱发 染色体型畸变，而作用于G2期时则诱发染色体单体型畸 变。给动物腹腔注射秋水仙素，抑制细胞分裂时纺锤体 的形成，增加中期分裂相细胞的比例，并使染色体丝缩 短、分散，轮廓清晰。在显微镜下便可观察染色体数目 和形态。
选择毒理学试验的基本原则
8.保健食品新原料 保健食品新原料（以下简称新原料）是指不在 国家食品药品监督管理局公布的可用于保健食品、 卫生部公布或批准可以食用以及生产普通食品的范 围内，拟用于保健食品的原料。 国家食品药品监督管理局和国家有关部门规定 的不可用于保健食品以及禁止使用的物品，不得作 为新原料。