ExoIII介导的LIC高效克隆系统的建立及载体重建
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pBKS-CS pBKS-N- Flag pcDNA3.1-CS pcDNA3.1-N-Fla pcDNA6-CS pcDNA6-N-Flag pBOB-CS pBOB-N-Flag
pBKS-N-HA
pBKS-N-Myc
pcDNA3.1-N-HA
pcDNA3.1-N-Myc
pcDNA6-N-HA
pcDNA6-N-Myc
载体重建
• • • • pBKS pcDNA3.1 pcDNA6 pBOB-CMV
通用序列：（No-tag）
Kpn I Cla I EcoR I EcoR V Bgl II BamH I Hpa I GGT ACC ATC GAT GAA TTC GAT ATC AGA TCT GGA TCC GTT AAC
700
Amount of clones(cfu)
600 500 400 300 200 100 0 0 20
25, 629
40
60
80
100
120
DNA concentration(ng)
25-50ng 载体和片段
最高效的克隆条件
1. 用ExoIII（20units）处理含目的片段和载体的 反应体系； 2. 4℃ 下反应1h； 3. 保证目的片段和载体的浓度在25-50ng之间；
PET 28a 100ng 4ul Gene-A3 100ng 1ul 10ⅹExo Ⅲbuffer 1ul Ddw 4ul +Exo III 20units 室温 5min 转化、涂板 15h 5 个克隆
寻求适合的条件来延长ExoIII处理的时间
条件优化一
Time cause for the Exo III(20units) in 4℃:
Amount of clones(cfu)
800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 100 200 300 400 500 600
60, 675
Exo III processing time(min)
4℃,60 minutes
条件优化二
DNA concentration ladder:
获得5'粘性末端wk.baidu.com
获得同源序列
用带同源序列的引物对目的基因进行扩增， 即可获 得带同源序列的目的片段和载体。
Vector
Gene
引物
Gene
我们最关注的问题是： 采用ExoIII是否能进行高效的克隆？
二、实验过程
ExoIII的验证
条件的优化和系 统的建立
载体重建
用ExoIII进行处理，能够达到高效克隆的目的
仅需要用同一对引物对目的基因进行PCR即可 同时将其接进不同的载体，并带上不同的tag
pBOB-N-HA
pBOB-N-Myc
pBKS-C-Flag
pBKS-C-HA
pcDNA3.1-C-Flag
pcDNA3.1-C-HA
pcDNA6-C-Flag
pcDNA6-C-HA
pBOB-C-Flag
pBOB-C-HA
pBKS-C-Myc
pcDNA3.1-C-Myc
pcDNA6-C-Myc
pBOB-C-Myc
Exo III 介导的LIC高效克隆系统 的建立及载体重建
答辩人：梁耀极
导
师：韩家淮
• L I C背景
•总
结
一、 L I C 背景
经典连接克隆方法的极限：
1. 长片段进大载体难度大；
2. 酶切位点有限，受酶切位点限制大。
L I C
Ligation Independent Cloning
LIC原理
N-terminal
Stu I Xba I Xho I Hind III Sma I Sal I Sac I
AGG CCT TCT AGA CTC GAG AAG CTT CCC GGG TAG GTC GAC GAG CTC
C-terminal
经改造的载体都带上了共有的序列
我们所获得的带通用序列的载体：
带缺口和突出端的DNA复合物在细菌中能被 有效地修复
载体和目的片段间，只要带有足够长的同源 粘性末端（>8bp），经退火，转化E.coil. 即 可获得完整的质粒DNA
如何获得粘性末端
如何获得同源序列
获得粘性末端
ExoIII 全名 Exonuclease III(核酸外切 酶III)，其 具有3’=>5’的外切酶活性
pBKS-N-HA
pBKS-N-Myc
pcDNA3.1-N-HA
pcDNA3.1-N-Myc
pcDNA6-N-HA
pcDNA6-N-Myc
载体重建
• • • • pBKS pcDNA3.1 pcDNA6 pBOB-CMV
通用序列：（No-tag）
Kpn I Cla I EcoR I EcoR V Bgl II BamH I Hpa I GGT ACC ATC GAT GAA TTC GAT ATC AGA TCT GGA TCC GTT AAC
700
Amount of clones(cfu)
600 500 400 300 200 100 0 0 20
25, 629
40
60
80
100
120
DNA concentration(ng)
25-50ng 载体和片段
最高效的克隆条件
1. 用ExoIII（20units）处理含目的片段和载体的 反应体系； 2. 4℃ 下反应1h； 3. 保证目的片段和载体的浓度在25-50ng之间；
PET 28a 100ng 4ul Gene-A3 100ng 1ul 10ⅹExo Ⅲbuffer 1ul Ddw 4ul +Exo III 20units 室温 5min 转化、涂板 15h 5 个克隆
寻求适合的条件来延长ExoIII处理的时间
条件优化一
Time cause for the Exo III(20units) in 4℃:
Amount of clones(cfu)
800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 100 200 300 400 500 600
60, 675
Exo III processing time(min)
4℃,60 minutes
条件优化二
DNA concentration ladder:
获得5'粘性末端wk.baidu.com
获得同源序列
用带同源序列的引物对目的基因进行扩增， 即可获 得带同源序列的目的片段和载体。
Vector
Gene
引物
Gene
我们最关注的问题是： 采用ExoIII是否能进行高效的克隆？
二、实验过程
ExoIII的验证
条件的优化和系 统的建立
载体重建
用ExoIII进行处理，能够达到高效克隆的目的
仅需要用同一对引物对目的基因进行PCR即可 同时将其接进不同的载体，并带上不同的tag
pBOB-N-HA
pBOB-N-Myc
pBKS-C-Flag
pBKS-C-HA
pcDNA3.1-C-Flag
pcDNA3.1-C-HA
pcDNA6-C-Flag
pcDNA6-C-HA
pBOB-C-Flag
pBOB-C-HA
pBKS-C-Myc
pcDNA3.1-C-Myc
pcDNA6-C-Myc
pBOB-C-Myc
Exo III 介导的LIC高效克隆系统 的建立及载体重建
答辩人：梁耀极
导
师：韩家淮
• L I C背景
•总
结
一、 L I C 背景
经典连接克隆方法的极限：
1. 长片段进大载体难度大；
2. 酶切位点有限，受酶切位点限制大。
L I C
Ligation Independent Cloning
LIC原理
N-terminal
Stu I Xba I Xho I Hind III Sma I Sal I Sac I
AGG CCT TCT AGA CTC GAG AAG CTT CCC GGG TAG GTC GAC GAG CTC
C-terminal
经改造的载体都带上了共有的序列
我们所获得的带通用序列的载体：
带缺口和突出端的DNA复合物在细菌中能被 有效地修复
载体和目的片段间，只要带有足够长的同源 粘性末端（>8bp），经退火，转化E.coil. 即 可获得完整的质粒DNA
如何获得粘性末端
如何获得同源序列
获得粘性末端
ExoIII 全名 Exonuclease III(核酸外切 酶III)，其 具有3’=>5’的外切酶活性