8现代食品微生物检验技术
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– 荧光抗体法；荧光抗原法
第一节 免疫学技术
• 二、免疫荧光技术
– 免疫荧光细胞（或组织）化学技术 – 根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素
制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检 查细胞或组织内的相应抗原（或抗体） – 直接法、夹心法、间接法和补体法
第一节 免疫学技术
PCR反应示意图
第二节 分子生物学方法
• 一、PCR技术
– （二）PCR技术的应用 – 对未知序列的扩增 – 利用不对称PCR完成单链DNA扩增 – 食品中致病菌和生活饮用水的指示菌的分析
PCR反应示意图
第二节 分子生物学方法
• 二、核酸探针杂交技术
– （一）核酸探针杂交技术的基本原理 – 在核酸变性及复性原理基础上建立起来的实验技术 – 核酸探针是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，
第一节 免疫学技术
• 二、免疫荧光技术
– 将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来研 究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法
– 荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细 胞定位
– 异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RIB200）、四甲基异 硫氰酸罗丹明（TRITC）
性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的检测技术 – 基本原理是将抗原或抗体预先结合到某种固相载体表面，测定时，
将待测样品（含待测抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按一定程序 与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原一抗体复合物， 经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物即被同 相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过分析有色产物量即可 确定样品中待测物质含量
– “三明治夹心”实验
双抗体夹心法
第一节 免疫学技术
• 一、酶联免疫吸附技术
– ELISA检测的主要步骤 – 将含有已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板的小孔内，洗涤一次；
加入待测抗原，洗去未结合的抗原；加入与待测抗原特异性结合 的酶联抗体，使形成夹心；加入该酶的底物，若产生有色的酶解 产物，说明存在与已知抗体特异结合的抗原
第一节 免疫学技术
• 五、放射免疫技术
– RIA的基本原理，是利用标记抗原（*Ag）和非标记抗原 （Ag）对特异性抗体（Ab）发生竞争性结合
竞争结合反应
第一节 免疫学技术
• 五、放射免疫技术
放射免疫分析原理示意图
第一节 免疫学技术
• 五、放射免疫技术
– 操作程序
抗原标准曲线
第一节 免疫学技术
第一节 免疫学技术
• 五、放射免疫技术
– 放射免疫分析、同位素免疫技术或放射免疫测定法 – 一种将放射性同位素测量的高度灵敏性、精确性与抗原
抗体反应的特异性相结合的体外测定超微量（10-15—109g）物质的新技术 – 操作简便、迅速、准确可靠，应用范围广，可自动化或 用计算机处理，但需一定设备、仪器，对抗原抗体纯度 要求较严格
• 五、放射免疫技术
– 3个关键性技术问题 – 标记抗原。要求其纯度高、免疫化学活性好、比放射性
强、用量适当 – 制备抗体。要求其特异性高、选用的稀释度适当。 – 分离B与F。理想的分离方法应当是分离完全、稳定可靠、
操作简单、适用范围广
第二节 分子生物学方法
• 一、PCR技术
– （一）PCR的工作原理
见的抗原条带显示出来
第一节 免疫学技术
• 四、乳胶凝集试验
– 间接凝集试验 – 以聚苯乙烯乳胶微粒作为惰性载体，用人工大分子乳胶颗粒标记
抗体，使之与待测抗原发生肉眼可见的凝集反应，以达到检测目 标病原微生物或毒素的目的 – 传统的乳胶凝集试验分试管法与玻片法 – 乳胶凝集试验的灵敏度和特异性都比较高
• 三、免疫印迹技术
– 根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法 – 在凝胶电泳和同相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫
生化技术 – 用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析
第一节 免疫学技术
• 三、免疫印迹技术
– 基本原理是将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离， 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场 力或其他外力作用下，使凝胶中的单一抗原组分转移到印迹纸上， 并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫 酶探针等，对抗原固定化基质膜进行检测和分析
第一节 免疫学技术
• 三、免疫印迹技术
– 3个步骤 – 抗原分离:聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将含有目标蛋白
（抗原）的样品按分子大小和所带电荷的不同分成不同的区带 – 第二为抗原印迹:电转移，目的是将凝胶中已分离的条带转移至
硝酸纤维素膜上 – 第三为抗原检定:酶免疫定位，是将前两步中已分离但肉眼看不
• 基本原理是抗体和抗原之间的相互作用，其中抗原和抗体之 间所发生反应的特异性和灵敏性是免疫检测技术的关键
• 常规免疫检测技术主要是用于检测抗原或抗体的体外免疫血 清学反应或免疫血清学技术
第一节 免疫学技术
• 一、酶联免疫吸附技术
– 将抗原和抗体的特异性反应与酶的催化作用有机地结合的一种新 技术
– 广泛应用于各种Βιβλιοθήκη Baidu原和抗体的定性和定量测定 – 食品病原菌检测最常用的分析方法，是一种把抗原和抗体的特异
杂交后又能用特殊方法检测的被标记的已知核苷酸链 – 应用核酸探针就可以检测待测核酸样品的特定基因序列
第二节 分子生物学方法
• 二、核酸探针杂交技术
– （二）核酸探针杂交技术的应用 – 细菌总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌、致病菌以及毒素 – 目标DNA的互补序列 – rRNA为靶目标的检验 – 进行食品微生物检验比传统方法更加准确、灵敏，但同
第八章 现代食品微生物检验技术
第八章 现代食品微生物检验技术
第一节 免疫学技术
• 免疫学技术是以抗原抗体的特异性反应为基础发展起来的一 种技术
• 免疫学方法检测灵敏度高、特异性好，而且快速、简便，所 以其发展迅速，广泛应用于生物分析检测
• 免疫检测技术是以一种抗体或多种抗体作为分析试剂，对待 测物进行定量或定性分析的检测方法
第一节 免疫学技术
• 一、酶联免疫吸附技术
– 双抗体夹心法测抗原或抗体 – 间接法测抗体 – 双位点一步法 – 竞争法 – 捕获法测IgM抗体 – ABS（avidin biotin system）-ELISA法 – PCR-ELISA法 – 斑点免疫酶结合试验（DIA）
第一节 免疫学技术
• 一、酶联免疫吸附技术
第一节 免疫学技术
• 二、免疫荧光技术
– 免疫荧光细胞（或组织）化学技术 – 根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素
制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检 查细胞或组织内的相应抗原（或抗体） – 直接法、夹心法、间接法和补体法
第一节 免疫学技术
PCR反应示意图
第二节 分子生物学方法
• 一、PCR技术
– （二）PCR技术的应用 – 对未知序列的扩增 – 利用不对称PCR完成单链DNA扩增 – 食品中致病菌和生活饮用水的指示菌的分析
PCR反应示意图
第二节 分子生物学方法
• 二、核酸探针杂交技术
– （一）核酸探针杂交技术的基本原理 – 在核酸变性及复性原理基础上建立起来的实验技术 – 核酸探针是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，
第一节 免疫学技术
• 二、免疫荧光技术
– 将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来研 究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法
– 荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细 胞定位
– 异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RIB200）、四甲基异 硫氰酸罗丹明（TRITC）
性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的检测技术 – 基本原理是将抗原或抗体预先结合到某种固相载体表面，测定时，
将待测样品（含待测抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按一定程序 与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原一抗体复合物， 经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物即被同 相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过分析有色产物量即可 确定样品中待测物质含量
– “三明治夹心”实验
双抗体夹心法
第一节 免疫学技术
• 一、酶联免疫吸附技术
– ELISA检测的主要步骤 – 将含有已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板的小孔内，洗涤一次；
加入待测抗原，洗去未结合的抗原；加入与待测抗原特异性结合 的酶联抗体，使形成夹心；加入该酶的底物，若产生有色的酶解 产物，说明存在与已知抗体特异结合的抗原
第一节 免疫学技术
• 五、放射免疫技术
– RIA的基本原理，是利用标记抗原（*Ag）和非标记抗原 （Ag）对特异性抗体（Ab）发生竞争性结合
竞争结合反应
第一节 免疫学技术
• 五、放射免疫技术
放射免疫分析原理示意图
第一节 免疫学技术
• 五、放射免疫技术
– 操作程序
抗原标准曲线
第一节 免疫学技术
第一节 免疫学技术
• 五、放射免疫技术
– 放射免疫分析、同位素免疫技术或放射免疫测定法 – 一种将放射性同位素测量的高度灵敏性、精确性与抗原
抗体反应的特异性相结合的体外测定超微量（10-15—109g）物质的新技术 – 操作简便、迅速、准确可靠，应用范围广，可自动化或 用计算机处理，但需一定设备、仪器，对抗原抗体纯度 要求较严格
• 五、放射免疫技术
– 3个关键性技术问题 – 标记抗原。要求其纯度高、免疫化学活性好、比放射性
强、用量适当 – 制备抗体。要求其特异性高、选用的稀释度适当。 – 分离B与F。理想的分离方法应当是分离完全、稳定可靠、
操作简单、适用范围广
第二节 分子生物学方法
• 一、PCR技术
– （一）PCR的工作原理
见的抗原条带显示出来
第一节 免疫学技术
• 四、乳胶凝集试验
– 间接凝集试验 – 以聚苯乙烯乳胶微粒作为惰性载体，用人工大分子乳胶颗粒标记
抗体，使之与待测抗原发生肉眼可见的凝集反应，以达到检测目 标病原微生物或毒素的目的 – 传统的乳胶凝集试验分试管法与玻片法 – 乳胶凝集试验的灵敏度和特异性都比较高
• 三、免疫印迹技术
– 根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法 – 在凝胶电泳和同相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫
生化技术 – 用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析
第一节 免疫学技术
• 三、免疫印迹技术
– 基本原理是将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离， 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场 力或其他外力作用下，使凝胶中的单一抗原组分转移到印迹纸上， 并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫 酶探针等，对抗原固定化基质膜进行检测和分析
第一节 免疫学技术
• 三、免疫印迹技术
– 3个步骤 – 抗原分离:聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将含有目标蛋白
（抗原）的样品按分子大小和所带电荷的不同分成不同的区带 – 第二为抗原印迹:电转移，目的是将凝胶中已分离的条带转移至
硝酸纤维素膜上 – 第三为抗原检定:酶免疫定位，是将前两步中已分离但肉眼看不
• 基本原理是抗体和抗原之间的相互作用，其中抗原和抗体之 间所发生反应的特异性和灵敏性是免疫检测技术的关键
• 常规免疫检测技术主要是用于检测抗原或抗体的体外免疫血 清学反应或免疫血清学技术
第一节 免疫学技术
• 一、酶联免疫吸附技术
– 将抗原和抗体的特异性反应与酶的催化作用有机地结合的一种新 技术
– 广泛应用于各种Βιβλιοθήκη Baidu原和抗体的定性和定量测定 – 食品病原菌检测最常用的分析方法，是一种把抗原和抗体的特异
杂交后又能用特殊方法检测的被标记的已知核苷酸链 – 应用核酸探针就可以检测待测核酸样品的特定基因序列
第二节 分子生物学方法
• 二、核酸探针杂交技术
– （二）核酸探针杂交技术的应用 – 细菌总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌、致病菌以及毒素 – 目标DNA的互补序列 – rRNA为靶目标的检验 – 进行食品微生物检验比传统方法更加准确、灵敏，但同
第八章 现代食品微生物检验技术
第八章 现代食品微生物检验技术
第一节 免疫学技术
• 免疫学技术是以抗原抗体的特异性反应为基础发展起来的一 种技术
• 免疫学方法检测灵敏度高、特异性好，而且快速、简便，所 以其发展迅速，广泛应用于生物分析检测
• 免疫检测技术是以一种抗体或多种抗体作为分析试剂，对待 测物进行定量或定性分析的检测方法
第一节 免疫学技术
• 一、酶联免疫吸附技术
– 双抗体夹心法测抗原或抗体 – 间接法测抗体 – 双位点一步法 – 竞争法 – 捕获法测IgM抗体 – ABS（avidin biotin system）-ELISA法 – PCR-ELISA法 – 斑点免疫酶结合试验（DIA）
第一节 免疫学技术
• 一、酶联免疫吸附技术