免疫学诊断技术

间接法 双标记法
(二)流式细胞术(flow cytometry，FCM) 免疫荧光技术应用于流式细胞仪,可对细胞的表面标
志(抗原或受体)进行快速、精确的分析和自动检测, 并可将不同类型的细胞分选收集。
FCM还可对同一细胞的多种参数(如DNA、RNA、蛋白
质和细胞体积等)进行多信息分析，是生命科学研究 领域广泛应用的一项新技术。
3. 反向间接凝集反应
载体颗粒
抗体
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可溶性抗原
可溶性抗原(如：血清蛋白质、细胞裂解 液等)与相应抗体结合后出现沉淀物，此类反 应称为沉淀反应(precipitation)。
液相沉淀反应
絮状沉淀反应
环状沉淀反应
抗血清 抗原
+—
抗原 抗体
+—
免疫比浊法：
¾ 在定量抗体中分别加入不同浓度的抗原，经一定
2 间接荧光法：首先用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素 标记的二抗染色。优点: 敏感性高，制备一种荧光素标记的 二抗可用于多种抗原的检查。缺点：非特异性荧光容易增多。
3 补体结合免疫荧光法 在抗原-抗体反应时加入补体，使之 与抗原-抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗补体抗体进 行示踪。
直接法 补体法
应用已知抗体或抗原检测未知抗原或抗体，可以对感 染性、非感染性致病因子或疾病相关因子进行诊断或辅助 诊断。
1、特异性 2、适合比例性 3、可逆性
抗原抗体反应的特异性：
z 一种抗原一般只能与由它刺激所产生的抗体结合，这种
抗原抗体结合反应的专一性即特异性。
z 抗原抗体结合力的大小，常用亲和力(affinity)或亲合
用途 免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定 免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定 免疫组化 免疫分析测定
用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检 标本中的抗原反应，抗原抗体复合物散发荧光， 借此对标本中的抗原作鉴定和定位。
(一)免疫荧光显微技术
1 直接荧光法：将荧光素直接标记抗体，作标本染色。优点: 简便易行。缺点: 每检查一种抗原必须制备相应的荧光抗体。
颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应 抗体结合后形成凝集团块，这一类反应称 为凝集反应(agglutination)。该类反应 可检测到ug/ml水平的抗体。
1. 直接凝集反应
细菌或红细胞 等颗粒性抗原
抗体
2. 正向间接凝集反应
载体颗粒
可溶性抗原 例如，用γ球蛋白包被的胶乳颗粒,检测病人血清中的 抗人γ球蛋白的抗体(类风湿因子)。
力(avidity)来表示。
z 亲和力是指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原
决定基之间的结合强度。
z 亲合力是指整个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。
适合比例性：
抗体含量
抗原含量
前带
等价带
后带
在抗原抗体特异性反应时，当抗原与抗体达到最适比例时，沉淀物形成 最多。如果抗原或抗体极度过剩则无沉淀物形成，这种现象称为带现象。 出现在抗体过量时，称为前带。在抗原过量时，称为后带。
免疫PCR(immuno-PCR，IM-PCR) 是将免疫反应的特异性与 聚合酶链反应(PCR)的敏感性相结合的免疫学检测技术。
★ 首先用连接分子(如biotin) 将DNA分子连接到抗体上；然后
与吸附在固相载体上的待测抗原结合，形成抗原-抗体-DNA 复合物；然后用特异性引物对DNA进行PCR扩增，检测其 扩增产物，可定量测定与DNA标记抗体相对应的抗原。
免疫标记技术(immunolabelling technique)是指用荧光素、 放射性核素、酶、发光剂或电子致密物质(胶体金、铁蛋白) 作为示踪剂标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。
此类方法具有灵敏、特异、快速，能够定性、定量甚至 定位测定，结果易于观察、适合自动化检测等很多优点。广 泛用于各种生物活性物质的分析鉴定与定量检测。
根据是否使用固相支持物作为吸附抗体(或抗原)的载 体，可分为固相EIA和液相EIA两类方法。其检测的敏感度 达ng~pg/ml水平。
常用的固相EIA法是酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，此法以聚苯乙烯制品或 NC膜等作为固相载体。
(1)双抗体夹心法：用于检查特异抗原。首先将已知抗体 包被在酶联板上，加入待检标本，标本中若含有相应 抗原即与固相上的抗体结合，洗涤去除未结合成分， 加入抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记抗 体，加底物后显色。一般而言，包被抗体和酶标记抗 体是识别同一抗原上的不同抗原决定基的2种抗体。
在IGS的基础上，可用银离子增强免疫金标记技术的敏
感性，称为免疫金银染色法(immunogold silver staining，IGSS)。
第三节 免疫细胞的检测
一、免疫细胞的分离与纯化
(一)白细胞的分离 血液中红细胞与白细胞的比例约为600～1000:1，两类细胞 比重(密度)不同，沉降速度各异，可采用下述方法分离。 1.自然沉降法: 采用肝素抗凝静脉血，由于红细胞的沉降率 较快，可使白细胞与之分离。 2.高分子聚合物加速沉降法 某些高分子聚合物(如明胶、 右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等)可使红细胞呈 钱串状凝聚，加速其沉降，从而更易与白细胞分离。
利用生物发光物质(如萤火虫荧光素)或参与生物 发光反应的辅助因子(如ATP、NAD等)标记抗原或抗 体，利用生物发光反应进行检测。
3.化学发光酶免疫测定(chemiluminescence enzyme immunoassav，CLEIA): 反应步骤与酶免疫测定相同， 酶促反应所用的底物为发光剂，通过化学发光反应进 行检测。 4.电化学发光免疫测定(ECLIA)，该法是在电极表面由 电化学引发的特异性化学发光反应。
三、免疫酶标技术
以酶标记抗体(或抗原)用于免疫学检测，通 过酶催化底物显色，对细胞或组织标本中的抗 原-抗体复合物进行定位、定性分析；亦可根据 酶催化底物显色的深浅程度，定量测定体液中抗 原或抗体的含量。
(一)酶免疫组织化学技术(enzyme immunohistochemistry,EIH)
通过酶解底物、显色来示踪抗原抗体结合物的存在部位。 酶免组化染色标本可在普通光学显微镜下观察，并能长期
免疫学诊断技术
军事医学科学院附属医院 陈建魁
主要内容：
第一节 抗原抗体反应 第二节 免疫学检测常用标记技术 第三节 免疫细胞的检测 第四节 免疫分子的检测 第五节 免疫相关基因的检测 第六节 免疫学检测方法的应用
第一节 抗原抗体反应
抗原抗体反应: 抗原与相应抗体在体内或体外发生的 特异性结合反应。
根据标记物与检测方法不同，标记 技术可分为:
¾ 免疫荧光技术 ¾ 放射免疫测定 ¾ 免疫酶标技术 ¾ 发光免疫分析 ¾ 免疫金标记技术
主要的免疫标记物
类别 荧光素
标记物 FITC、 藻红蛋白（PE）
放射性核素 3H、51Cr 、32P、 125I、131I
酶
HRP、AP
化学发光物 Luminol 金属颗粒 胶体金
四、发光免疫技术
发光免疫测定(luminescence immunoassay， LIA)是将发光系统与免疫反应相结合，用于检测抗 原或抗体。
1.化学发光免疫测定 (chemiluminescenee immunoassay，CLIA)
以化学发光剂(如鲁米诺、吖啶酯等)标记抗体或 抗原，免疫反应完成后，直接引发化学发光反应进行 检测。 2.生物发光免疫测定 (bioluminescence immunoassay，BLIA)
保存。
辣根过氧化物酶的底物二氨基联苯胺(DAB)的分解产物适
于电镜观察。
常用的方法：亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin
– biotin - peroxidase complex，ABC) ，过氧化物酶-抗过 氧化物酶法(PAP)和碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法(APAAP)。
(二)酶免疫测定(enzyme immunoassay，EIA) 1.非均相酶免疫测定(heterogeneous enzyme immunoassay)
时间后可形成免疫复合物。
¾ 用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越
多，浊度越高，可根据标准曲线计算出样品中的 抗原含量。
¾ 该法快速简便，可取代免疫扩散法测定Ig含量。
凝胶内沉淀反应
免疫扩散技术
免疫电泳技术
单向扩散试验 双向扩散试验
火箭电泳
对流电泳
Ag Ab Ag
免疫电泳
第二节 免疫学检测常用的标记技术
(2)间接法：用于检查特异抗体。用已知抗原包被 固相，加入待检血清标本，再加酶标 记的二抗，加底物观察显色反应。
免疫印迹法(Immunoblotting)： 它将凝胶电泳与固相免疫结合，是把电泳分区
的蛋白质转移至固相载体，再用酶免疫、放射 免疫等技术测定。 此法能分离不同分子大小的蛋白质并确定其分 子量，常用于检测病毒的抗体或抗原。
电化学发光（electrochemiluminescence，ECL)是在电极表面 引发的特异性化学发光反应，包括电化学和化学发光两个过程。
化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+和三丙胺（TPA）在阳电 极表面同时各失去一个电子发生氧化反应。二价的[Ru(bpy)3]2+被 氧化成三价，后者是一种强氧化剂。可将TPA氧化成阳离子自由基 TPA+*，后者很不稳定，自发地失去一个质子（H+），形成自由基 TPA*，这是一种非常强的还原剂。可将三价的[Ru(bpy)3]3+还原成 激发态的二价[Ru(bpy)3]2+*。接着激发态的 [Ru(bpy)3]2+*衰减成 基态的[Ru(bpy)3]2+，同时发射一个波长620nm的光子。 TPA*自身 被氧化成二丙胺和丙醛。
这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光 信号得以增强。
五、免疫金标记技术 免疫金标记技术(immunogold labelling technique)
是以胶体金作为示踪标志物用于抗原抗体反应检测。
胶体金标记的抗体可直接用于检测细胞表面和组织切
片中的抗原或受体，并可在普通光学显微镜下观察， 称为免疫金染色法(immunogold staining，IGS)。
主要用于小分子物质(特别是药物浓度)的测定。
2.时间分辨荧光免疫测定 (time-resolved fluoro -immunoassay，TR-FIA)
镧系稀土元素具有较长的荧光寿命，用其标 记抗原或抗体，并利用时间分辨荧光分析仪延缓 测量时间，可以消除非特异性本底荧光的干扰， 所得信号完全是特异荧光，此法灵敏度高、特异 性好。
3.酶联荧光免疫测定(enzyme linked fluoro -immunoassay，ELFIA)
应用具有潜在荧光的物质作为酶的底物， 经过酶解反应产生高强度荧光，可用荧光仪进 行定量测定。
放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)是 用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测的 技术。将放射性核素的高灵敏性和抗原抗体反应 的特异性相结合,使检测的敏感度达pg/ml水平。 常用的放射性核素有125I和131I。常用于微量物质 测定，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等 激素，吗啡、地高辛等药物以及IgE等。
★ 该法与ELISA基本相似，不同的是用DNA标记代替了酶标
记，通过观察PCR扩增产物来判定结果。
2.均相酶免疫测定 (homogeneous enzyme immunoassay，HEI)
将待测样品、酶标试剂和底物溶液混合，待 抗原-抗体反应完成即可直接测定结果，整个检 测过程都在均匀的液相中进行。
(三)荧光免疫测定(fluoroimmunoassay，FIA)
1.荧光偏振免疫测定： (fluorescence polarization immunoassay，FPIA)
荧光物质经偏振光蓝光照射而跃入激发态，在恢复至基态 后可释放出光子，经偏振仪形成偏振光，测定其强度可得到样 品中待测物质的浓度。
抗体过剩
抗原抗体比例合适
抗原过剩
网格学说（lattice theory）
可逆性：
K（亲和常数）=
Ag+Ab Ag Ab
抗原抗体反应的影响因素
1、电解质浓度 2、酸碱度（pH: 6～8） 3、温度（37～42℃）
抗原抗体反应类型：
根据抗原性质、出现结果的现象、参与反应 成分的不同，可将抗原抗体反应分为： z 凝集反应 z 沉淀反应 z 补体参加的反应 z 采用标记物的抗原抗体反应等