黄色须腹菌液体菌剂保存温度及活性研究

黄色须腹菌液体菌丝菌剂保存温度及活性研究

马仕波，叶建仁*

(南京林业大学森林资源与环境学院，江苏南京210037)

摘要：选择有代表性的胞外酶进行测定，发现TTC脱氢酶与菌丝活力呈现出极显著的正相关，说明TTC脱氢酶酶活值的大小可以反映菌丝菌剂活力的高低。4℃时菌丝的絮状形态和活性能较好的保存下来，有利于液体菌丝菌剂的田间应用。所以液体菌丝菌剂的保存温度以4℃为宜。

关键词：黄色须腹菌，保存温度，菌丝活性

中图分类号：S718.81 文献标识码：A

Study on storage temperature and mycelium activity of Rhizopogon

luteous liquid mycelium agents

MA Shi-bo, YE Jian-ren*

(College of Forest Resources and Environment Nanjing Forestry University, Nanjing 210037) Abstract：It measured three typical extracellular enzyme activity. TTC dehydrogenase was significantly related to hyphal activity at 0.01 level. The TTC dehydrogenase activity could better reflect the dynamic strength of the fertilizer should be used as inocula vitality flag. In 4℃, the floc form of mycelium could be preserved, which was conducive to liquid mycelium agents direct application in the field. So, it should be appropriate to save liquid mycelium agents in 4℃.

Key words：Rhizopogon luteous；Storage temperature；Enzyme activity

液体菌剂的活性指标是外生菌根菌菌剂的保存效果的重要体现，目前用于检测外生菌根真菌菌剂的活性指标研究还鲜有报道[1]。黄色须腹菌菌丝发酵液能产生胞外酶，而且方便测定，本实验研究保存过程中的三种典型胞外酶活性，确定菌丝体活性的指标，为黄色须腹菌液体菌丝菌剂的菌丝活性检测提供理论依据[2]。同时研究菌丝的保存温度条件，以确定黄色须腹菌液体菌丝菌剂的最佳保存温度。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料

发酵罐发酵所得的黄色须腹菌菌丝体。

1.1.2试剂

葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素B1、氢氧化钠、盐酸、磷酸、聚乙烯醇、聚乙二醇、琼脂、马铃薯、有机硅消泡剂、对硝基磷酸钠、对硝基酚、邻苯二酚、浓硫酸、乙酸乙酯、TTC、连二亚硫酸钠。

收稿日期：2013-06-23 修回日期：

基金项目：国家林业局林业行业公益性项目No.201004061；国家“十二五”科技支撑项目(2012BAD19B0703)

作者简介：马仕波(1988-)，男，硕士。

*通讯作者（Corresponding Author）：叶建仁，男，教授，博士生导师。

1.1.3仪器

摇床、恒温培养箱、电子分析天平、pH 计、超净工作台、立式电热压力蒸汽灭菌锅、粉碎机、恒温电热鼓风干燥箱、上海国强自动搅拌新概念高级液体发酵罐。

1.2试验方法

1.2.1酸性磷酸酶的测定

取发酵液菌丝若干，用滤纸吸干发酵液，称取1g 菌丝样品，用5mL 研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm 下离心10min 。吸出上清液，即为酶粗提取液。放在冰箱储存备用。

取酶液0.5mL ，加水至1mL ，然后加入缓冲液1mL 和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL 。空白对照用1mL 研磨缓冲液代替酶制剂。充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min ，不时摇动。10min 后，加入1mL0.5molNaOH 溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。在400nm 波长下测吸光度A 。

以每毫克种子每分钟水解底物的nmol 数表示。

W

109V 3.1AV/0.01mg min /nmol 1⨯=⋅酶活性 式中0.019为pH=14时，对硝基酚的μmol 吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L 时的吸光度；3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将μmol 化为nmol 乘上1000；V 为酶制剂总体积；V 1为每次用酶体积。

1.2.2多酚氧化酶的测定

0.1 mol/L 邻苯二酚 2ml ，加入 0.05mol/L pH6.0 的磷酸缓冲液 2ml ，再加 0.5ml 酶液，28℃保温 30min ，测 400 nm 波长处的 OD 值。定义每分钟引起 0.01个吸光度的增加所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

1.2.3 TTC 脱氢酶的测定

取发酵液菌丝若干，用滤纸吸干发酵液，称取2g 菌丝于研钵中，加入6mL 0.5%TTC ，在35℃下保温2h ，后加2滴浓硫酸阻止反应，取出菌丝，用滤纸吸干TTC 溶液，放入研钵中，加入4 mL 乙酸乙酯，充分研磨菌丝。用移液枪吸出红色液体，并用乙酸乙酯洗菌丝到无红色液体出现，将洗涤液一并移到 25mL 刻度中，并定容至 15mL ，以乙酸乙酯为参比，在 485nm 下测其吸光值。定义每克干物每小时引起 0.01 个吸光度的变化所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

标准曲线的制作：在小烧杯中加入0.4ml pH 为7.5 的 0.5%TTC 溶液，20ml 的乙酸乙酯和少量还原剂连二亚硫酸钠，然后混合摇动使生成红色的 TF ，用移液枪分别吸取红色溶液 0.25、0.5、1.0、1.5 和 2.0ml ，加入乙酸乙酯定容至 5ml ，在 485nm 处测相应的光密度值，制作标准曲线。

TTC 脱氢酶活性的定义：一定量的鲜菌丝，在一定温度和 pH 下，与 TTC 溶液反应单位时间内还原所生成的 TF 量(1U=1μgTF/h/m)。