试验一碱裂解法抽提质粒DNA

3 仪器及设备 • 高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、 台式离心机、漩涡振荡器 • 培养用试管、量筒、冰盒、微量离心管、 微量取液器、吸管头若干
四、实验步骤
1.细菌的培养
（1）配制LB液体和琼脂培养基，并高压灭菌 （2）当培养基不烫手时把Amp加入琼脂培养基中倒平板 使终浓度为Amp100µ g/ml （3）在Amp100µ g/ml的琼脂培养基平板上用接种环划线 分别培养出含mp3和psk质粒的大肠杆菌的单菌落 （37℃.18-20个小时） （4）取2支灭菌的12mL培养管，加入2.5mL液体LB培养 基和2.5μLAmp母液（1000x） （5）用灭菌的镊子夹一个灭菌的牙签，在单菌落上沾 一下放入液体培养基中
基因工程实验
实验一：碱裂解法抽提 质粒DNA
一、实验目的
学习并掌握基因工程操作技术中最常 用的载体质粒DNA的提取方法。
二、实验原理
碱裂解法主要利用共价闭合环状质粒和线 性染色质在拓扑学上的差异。
NaOH和SDS溶液使细胞裂解，在碱性 溶液中，线性的大分子量细菌染色体DNA 氢键断裂，双螺旋结构遭破坏而发生变性， 但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环 状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下， 两条互补链也不会充分分离。
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细菌培养后可通过肉眼观察分辨是否有杂菌： 大肠杆菌的应为乳白色或淡黄色，有杂菌的 会发红 氯仿有毒性，见光会产生有毒光气，所以要 保存于棕色瓶里，任何涉及氯仿的操作都要 在通风厨内使用。并且氯仿会溶解塑料，吸 取时把离心管靠近些 RNaseA可加入TE中，也可加入SolutionⅠ中 加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ摇匀时一定要温和，不 能剧烈摇动
六、思考题
1 为什么真核生物基因组DNA不能用碱法抽提？
答：碱法提取质粒是利用共价闭合环状质粒和线性染色 质在拓扑学上的差异。当线性的基因组DNA遇到强碱 后，产生不可逆的变性，而质粒DNA由于处于拓扑缠 绕状态而不能彼此分开，当条件适合时，质粒DNA又 恢复了原来的结构。 真核生物的基因组DNA为双螺旋结构，在在碱性溶 液中，双链DNA氢键断裂，双螺旋结构遭破坏而发生 变形，而基因组DNA分子量相对较大，在碱性PH条件 下其线性的大分子量基因组DNA不能复性，而形成缠 连的网状结构与蛋白质等共沉淀。
当加入中性缓冲液调和时，变性的质粒 DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA 不能复性，它们之间交联形成不溶性网状 结构，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结 合沉淀下来。 通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA 及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA 及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂 的RNA可用RNaseA消除。再用酚／氯仿处 理，可除残留蛋白质
12000rpm离心5min，倒掉酒精。离心几秒钟，用移液枪 尽可能除去酒精。用0.5ml 70%酒精洗DNA一次，离 心2min，倒掉酒精 70%酒精可以使DNA保持不溶解的状态，30%的水还可 以使离子洗去 离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精，风干十分钟 此时DNA变成无色透明 加入50ulTE（含50ug/mgRNaseA）溶解DNA沉淀。放置 金属浴65℃加热10min或37℃放置数小时 使RNaseA发挥作用，并且DNA酶在此条件下会失活 -20℃保存备用
三、材料、试剂及仪器
1 材料： （1）菌种E.coliDH 10B含质粒pSK （2）菌种E.coliDH 10B含质粒pMP3 2 试剂: LB培养基（ 固体和液体）;氨苄青霉素 (Amp,100mg/ml);20﹪SDS;溶液Ⅰ; 溶液Ⅱ （最好现配现用）;溶液Ⅲ（-20℃预冷）; 4N NaOH; 3MNaAc（PH5.2）;无水乙醇; TE缓冲 液（PH8.0）; RNaseA(10mg/ml); 70﹪乙醇;饱 和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
• 加入180uL预冷的溶液III，上下翻转十多下，温和混 匀，冰上静置10min或者放入-20℃冰箱5min : 使染色体DNA等沉淀，而质粒DNA复性 12000rpm，4℃离心5min。 • 取上清。加2/3体积的酚/氯仿12000rpm，混匀。 12000rmp离心5min ：用于抽提脂类，蛋白质等。 在混匀时，要盖紧盖子，用纸巾包住离心管，来回翻 转。离心后会发现溶液分三层，上层为含DNA，RNA 的水相，中间为蛋白质，下层为有机相 • • 移取上清液，加2倍体积的无水乙醇（大量提取时可以 用0.6倍的异丙醇代替），混匀：用于沉淀DNA，
3 质粒DNA的进一步纯化
加入TE使DNA溶液为200ul，加入等体积的酚/氯仿，充 分振荡：会分三层 12000rpm，离心5分钟，吸取上清液 加入等体积的氯仿， 12000rpm，离心5分钟，取上清 加入1/10体积的3MNaAc，加2倍体积的预冷的无水乙醇， 混匀。 置于-70℃冰箱约10min以上或者-20℃冰箱30min至数个 小时
12000rpm离心15分钟（4℃），倒掉酒精，离心几秒， 用移液枪尽可能除去酒精 用0.5ml70 %酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉酒 精 离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精，风干。 加30ulTE溶解DNA沉淀（TE不加RNase）
五、实验注意事项
1 挑菌落应挑单菌落。 可用牙签挑取，也可用tip头挑取。市场上买的 牙签上有防腐剂，应用沸水煮过之后，烘干用 2 细菌培养过程应注意保持细菌的通气性： （1）培养基的体积不能占培养管的体积太多 （2）培养管的体积不用盖太紧 （3）培养管倾斜培养：可增大细菌与氧气接触 面积 （4）转速为200rmp：快一点的转速有利于保持 其的通气性
（6）盖上盖子，将培养管倾斜插在摇床上，37℃过夜培 养（ 200rpm，14-16小时，一般不超过18小时）。
2 质粒DNA的提取
取1.5 ml菌液入1.5ml的离心管中 5000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体（如果想提取 多一点DNA，再吸取1.5ml菌液到同一离心管中，离心， 弃上清）:离心时离心管方向要固定，柄朝外，方便看 是否离下来 用移液枪尽可能除去来自百度文库清液，然后150uL溶液I悬浮菌体 用涡旋振荡器充分振荡 ：溶液I最好要放冰上 加入250uL溶液II，缓慢上下翻转离心管10多下，温和混 匀，冰上静置5min ：充分裂解菌体