食品安全国家标准 食品中诺如病毒检测

食品安全国家标准

食品微生物学检验食品中诺如病毒检测

1 范围

本标准本标准规定了食品中诺如病毒的测定方法。

本标准适用于食品中诺如病毒总数的测定。

2 术语和定义

2.1 实时荧光RT-PCR real-time fluorescence

在普通RT-PCR的基础上加了一条特殊性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

2.2 C

值 cycle threshold

t

每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。

3 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

3.1无菌平皿，直径90mm；

3.2无菌手术剪；

3.3无菌镊子；

3.4无菌50ml离心管，耐氯仿，可高速离心；

3.5无菌85ml离心管，耐氯仿，可高速离心；

3.6无菌胶头滴管；

3.7无菌移液管，10ml；

3.8移液枪，1-1000ul；

3.9匀浆机；

3.10超净工作台；

3.11天平，精密度为0.01g；

3.12高速冷冻离心机，10000g；

3.13恒温摇床；

3.14荧光定量PCR仪。

4 试剂

4.1 含0.3mol/lNaCl的甘氨酸缓冲溶液，配制方法见A.1；

4.2 PEG8000，配制方法见A.2；

4.3 病毒RNA提取试剂盒；

4.4 Nuclisens裂解液；

4.5逆转录试剂盒；

4.6荧光PCR定量试剂盒；

4.7 缓冲液1×TAE，配制方法见A.3；

4.8溴化乙锭（EB）溶液10ug/uL，配制方法见A.4；

4.9琼脂糖凝胶，配制方法见A.5。

5 检验程序

6 操作步骤

6.1诺如病毒的富集

6.1.1在无菌平皿中进行无菌取样，取食品5g，加入25ml含0.3mol/lNaCl的甘氨酸缓冲溶液，匀浆3min，为避免匀浆过程产生的高温破坏病毒，分两次匀浆，中间停顿1min。

6.1.2将均质液转移到50ml离心管中，恒温摇床37℃孵育30min或室温震荡30min，4℃，10000g离心30min。

6.1.3取上清，转移到另外的离心管中，加入10ml氯仿，充分震荡，放置10min，中间震荡一次，4℃，10000g离心30min。

6.1.4取上清液25ml转移到85ml离心管中，加入等体积的PEG8000溶液（PEG的终浓度为8%），充分震荡混匀。

6.1.5在冰上放置至少1h，4℃，10000g离心5min，弃上清，加入2mlNuclisens裂解液溶解沉淀，如不马上进行检测，将沉淀用1ml无菌水重悬，-70℃保存，避免反复冻融。

6.2诺如病毒RNA提取

使用商品化的病毒RNA提取试剂盒提取和纯化，步骤参考说明书，提取完成后，为延长RNA保存时间可选择性加入RNase抑制剂，操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套，并经常更换。

6.3实时荧光RT-PCR

以诺如病毒RNA作为阳性阳性对照，以不含诺如病毒的样品RNA作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照，每个体系设置两个平行反应.可根据具体情况调整总体积。

6.3.1 实时荧光RT-PCR反应体系

实时荧光RT-PCR反应体系见表1

6.3.2实时荧光RT-PCR检测所用引物和探针

实时荧光RT-PCR检测所用引物和探针见表2

表2 实时荧光RT-PCR检测所用引物和探针