RtPCR技术

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3. 反转录相关的背景知识——反转录酶 AMV逆转录酶（来自禽成髓细胞瘤病毒） 简介：具有双重活性： ①5’→3’依赖引物的聚合酶活性，可以以RNA或 DNA作为模板； ②具有3’→5’Rase H 活性，可以降解 RNA/DNA杂合体中的RNA，它需要Mg2+或 Mn2+激活。 AMV特点： 高灵敏度，可以高效扩增低至 1ng总RNA的模板。 高热稳定性，适合于扩增 复杂模板。
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2. 反转录的应用
获得目的基因； 构建cDNA文库 基因表达与调控的研究
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3. 反转录相关的背景知识——实验原理 反转录酶以mRNA为模板，dNTP为底物，在 引物的3′末端，按5′→3′方向，合成一条与 RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链称 为互补DNA (complementary DNA, cDNA)。
ห้องสมุดไป่ตู้
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3. 反转录相关的背景知识——第二链合成
引导合成法优点：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
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3. 反转录相关的背景知识——第二链合成
引物－衔接头合成法：
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反转录相关的背景知识——第二链合成
优点：获得的双链cDNA 能保留完整的5’ 端序列，且含有限制性酶切位点，可直接 用于克隆
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3. 反转录相关的背景知识——第一链合成 合成cDNA 第一链时需要引物，目前常用的引 物主要有三种，即 Oligo（dT），随机引物和 特异性引物。 Oligo（dT）含有 10～20 个脱氧胸腺嘧啶 核苷的寡核苷酸片段； 随机引物是含有6～10 个碱基的寡核苷酸片段； 特异性引物：根据需要合成的能与mRNA特异 性互补结合的引物。
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4. 实验操作——仪器 涡旋仪，0.5ml 微量离心管，恒温金属浴，台 式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，移液器，移 液器吸头。
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4. 实验操作——试剂 RNA, Oligo(dT), dNTP(10mM each ), RNase free water (DEPC treated), 5Xbuffer, RNase inhibitor(40U/μl), Reverse Transcriptase.
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3. 反转录相关的背景知识——反转录酶 Note: M-MuLV RT has much lower RNase H activity than Avian Myeloblastosis (AMV) reverse transcriptase. (Fermentas)
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3. 反转录相关的背景知识——第一链合成 以Oligo（dT）为引物
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3. 反转录相关的背景知识——第一链合成 因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到 2%, 所以与使用随机引物的方法相比, 得到的 cDNA数量和复杂度要低很多。这种 cDNA
合成的方法在 cDNA 文库构建中应用极 为普遍，。 缺陷：因为逆转录酶无法到达较长的 mRNA分子的5’ 末端，因此，对于大分 子量的较长的mRNA分子而言，特别麻 烦。
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3. 反转录相关的背景知识——反转录酶 常用的两种反转录酶：M-MuLV, AMV M-MuLV逆转录酶（来自 Moloey 鼠白血病 病毒） 简介： Moloney Murine Leukemia Virus(莫洛尼氏鼠白血病病毒, M-MuLV)逆 转录酶从E.coli菌株提取出来，此菌株含有一 个克隆有M-MuLV RT基因的质粒，M-MuLV 基因被删去了RNAase H 核心部分。 特点： RNase H活性超低，cDNA得率高。
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3. 反转录相关的背景知识——反转录酶 大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括 以下几种活性： ① 以RNA为模板的DNA聚合酶活性； ② RNase H活性； ③ 以DNA为模板的DNA聚合酶活性； ④ 除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活 性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体 DNA中有关。
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3. 反转录相关的背景知识——第一链合成 GSP引导的cDNA合成: 是以与mRNA 3’ 端配对的引物为起始，合成 互补的DNA单链。 为了充分利用GSP特异性的优点, 应该使用具 有较高热稳定性的逆转录酶，这样可以增加反 应的严谨性。
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3. 反转录相关的背景知识——第二链合成
cDNA 第二链的合成： 即将上一步形成的 mRNA-cDNA 杂合 双链变成互补双链 cDNA 的过程。 cDNA 第二链合成的方法有四种，自身 引导合成法，置换合成法，引导合成法和 引物－衔接头合成法。
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3. 反转录相关的背景知识——第二链合成
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3. 反转录相关的背景知识——第二链合成
0.5 μl
5 μl
E) 42 ℃，60 min，接着70 ℃保温15min, 然后冰上冷 却得到cDNA溶液。
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4. 实验操作——注意事项
实验过程中防止RNA降解 在冰上操作
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请思考
第一次70度水浴，第一次冰浴在实验中起什么 作用？ cDNA第一链能指数扩增吗？ RNase H 和RNase A的区别？
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3. 反转录相关的背景知识——第一链合成
随机引物引导的 cDNA 合成: 随机引物结合到mRNA 后，并以此作为 反转录的起点，在RT作用下合成cDNA。 随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建 cDNA 文库，一般用于克隆特定 mRNA 的 5‘ 末端，如 RT-PCR 和 5’-RACE ， 以及从带有复杂二级结构区域或带有逆转 录酶不能复制的终止位点区域获得cDNA。
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4. 实验操作——具体步骤 1）RNA提取： RNA提取质量的检测： ①电泳：如果28S条带的亮度是18S的2倍说 明提取的RNA质量好。 ②检测RNA溶液的吸光度 通常，我们只看OD260/OD280 的比值，提 取质量较好的RNA比值应该在1.8-2.2之间。 当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的 污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这 份RNA的命运。当R>2.2时，说明RNA已经 水解成单核苷酸了。
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反转录（rt）
授课人：薛高旭
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讲课内容
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什么是反转录
反转录的应用
反转录相关的背景知识 实验具体操作
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1. 什么是反转录 1970年Temin等在致癌RNA病毒中发现了一 种特殊的DNA聚合酶，该酶以RNA为模板，根 据碱基互补配对原则(其中U与A配对) ，合成 与RNA互补的DNA序列，因为这一过程与一般 的转录步骤恰好相反，故称为反转录，催化此 过程的DNA聚合酶叫做反转录酶(reverse transcriptase)。 简单地说，反转录就是由 mRNA 到 cDNA 的 过程。
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4. 实验操作——具体步骤
D) 如果需要再离心数秒，使混合液聚集于管底部，然后 再向管中加入下列反应液：
试剂名称
上述混合液 5X PrimeScript Buffer RNase Inhibitor (40U/ μl)
使用量
10 μl 4 μl 0.5 μl
PrimeScript Reverse Transcriptase (200U/ μl) RNase free water
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4. 实验操作——具体步骤
2）逆转录： A) 在 Microtube 管中配置 下列混合液： 试剂名称 RNA Oligo(dT) dNTP RNase free water 使用量 1 μl 1 μl 1 μl 7 μl
B) 离心数秒使混合液聚集于 Microtube 管底部； C) 65℃ 保温5分钟后迅速在冰上极冷2分钟以上；