精选植物细胞培养的技术

? 优点：细胞的生产能力高
? 缺点：细胞生长慢，培养时间长，要严 格保障系统的无菌状态。
? 在培养特定细胞或生产次级代谢产物时， 采用二阶段连续培养法。
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二阶段连续培养
? 第一罐中投入适于细胞增长的培 养基（即生长培养基）并连续加 入该培养基，第二罐中投入适于 产生次级代谢产物产生的培养基 （即生产培养基）
? MS 培养基和LS 培养基应用最广。
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1、无机盐
? 分为大量元素和微量元素 ，30mg/l 界限，大量有
氮、硫、磷、钾、镁、钙、氯、钠。微量有铁、 锰、碘、钼、铜、锌。某些情况下，还可加入镍、 铬或铝。
? 磷以磷酸盐的形式存在，浓度在 1.1~1.25mmol/l ，
磷的消耗很快与其他成分相互作用而被消耗殆尽， 但机体自身可产生磷可满足需要。
灭菌剂选择的 原则：尽可能的选择那些灭 菌后易于除去的试剂。灭菌剂的原则和处理时 间的长短取决与所选材料对试剂的敏感性，敏 感的外植物体的灭菌时间不宜过长。
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常用灭菌剂有次氯酸钙、次氯酸钠和氯 化汞。
次氯酸钙为工业漂白粉过滤后的饱和溶 液，适用于草本植物和柔软组织的灭菌处 理，时间为5-30min 。
氯化汞灭菌效果好，但不易除去，时间 不易过长，以免杀死植物细胞，当其用于 休眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为 0.1% ，2-10min ，种子皮较厚时可延长至 20min 以上。
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二、培养基及其组成
? 培养基实际上是植物离体器官、组织或细 胞的“无菌土壤”，其特点是营养成分的 可调控性。
? 植物细胞或组织培养基常含有无机盐、碳 源、有机氮源、植物生长激素、维生素等 成分。必需营养物是否加入、浓度的高低、 各族非得相对浓度等都会对培养结果产生 重大的影响，甚至起至关重要的作用。
? 植物细胞通常是维生素自养型，但大多 数不能满足自身的需要。对大多数培养 基而言，除了加入b 族维生素（如B1、 B2 和泛酸）外，还加入定量的生物素和 肌醇，后者构成 磷脂肌醇极性端的组分。 （细胞膜部分含磷脂肌醇2%~8% ）
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三、培养方法
? 培养对象：原生质体培养和单倍体细胞 培养等
? 培养基类型：固体培养和液体培养 ? 培养方式：悬浮细胞培养和固定化细胞
? 外植体在培养三周左右必须移至新鲜培养 基上，以保持继续生长。移换一次培养基 称为一次继代培养，经过一定次数的继代 培养，愈伤组织变得较为疏松时，方可进 行悬浮培养。
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液体培养
? 包括：小规模的悬浮培养和大规模的成批 培养、半连续和连续培养。
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悬浮培养
? 分为静止和振荡两类 ? 静止液体培养具有简便易行的特点，还不
? 大多数氮常以铵盐或硝酸盐形式提供。
? 钾、镁、钙、离子对细胞代谢必不可少，镁离子
参与多种辅酶和激活子的合成；钾离子、钙离子
可抑制某些酶的活性，有时钙离子也可保持某些
酶的活性或稳定性。微量元素的作用是参与辅酶
的形成，并可诱导酶的合成
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2 、碳源
? 植物细胞培养物通常为异养细胞。人们常 用碳源为碳水化合物、肌醇、甘油、乳糖 和半乳糖。有时培养基固化物（如琼脂） 也作为碳源。
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? 愈伤组织或细胞的生长和生存依赖于合成 的生长素或天然生长素，可诱导特异酶类， 包括与RNA 合成有关的酶。
? 植物组织和细胞培养物的生长过程主要取 决于生长素和分裂素的比例，比值高可刺 激细胞分裂，比值低则刺激细胞生长。但 过量的赤霉素或酚类化合物可掩盖上述现 象。对于植物培养细胞，绝大多数培养基 中都必须加入一定量的生长调节剂。
? 有些通过同化二氧化碳而获得全部能量， 即光自养培养物。
? 天然提取物如椰子乳、对愈伤组织的诱导 和培养也有重要意义。
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3 、植物生长调节剂
? 植物激素是植物代谢过程中形成的生长 调节物质，在极低浓度（<1μmol/l ）时 即能调节植物的生育过程，并能从合成 部位转运到作用部位而发挥作用。
? 植物激素只限于天然产生的调节物质。 常见的植物激素有生长素、分裂素、赤 霉素、脱落酸、乙烯。
培养
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ12
固体培养
? 包括利用琼脂作为支撑物的固体培养和固定化 细胞培养
? 特点：简便易行、培养所占空间少。 ? 缺点：愈伤组织生长不平衡；阻碍组织呼吸、
堆积有害物质；细胞间极化现象；测定生理生 化指标时会改变其形态生理状态 ? 最常用的固化剂：琼脂 ? 一般温度保持为（ 25 ±1）℃
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? 固体培养和液体培养互相配合仍是组织 （细胞）培养的常规操作。
? 两步培养法：使用两个 反应器。第一个用于细 胞生物量的累积，第二 个用于次级代谢产物的 生产。
5L 气升式植物细胞（或器官）培养罐
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半连续培养法
? 在反应器中投料和接种培养一段 时间后，将部分培养液和新鲜培 养液进行交换的培养方法。
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连续培养法
? 利用连续培养反应器，在投料和接种一 段时间后，以一定的速度连续采集细胞 和培养液，并以同样速度供给新鲜培养 基以使细胞生长环境维持恒定。
会出现营养物质浓度差的现象。
● 振荡液体培养，使 悬浮细胞在液体培养 基中，不断振动下进 行培养。可以克服静 止培养的许多缺点。
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成批培养法
? 将培养基一次性加入反应器中，接 种、培养一定时间后收获细胞的操 作方式。
? 反应器：气升式反应器 ? 方法：两步培养法
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? 气升式反应器：培养过 程用通气代替搅拌，避 免了使用机械搅拌所致 的细胞破碎、通气受限 制、培养物易被污染等 缺点，细胞产量也明显 高于机械搅拌式生物反 应器。
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4 、有机氮源
? 植物组织和细胞培养中常用蛋白质水解物或各 种氨基酸，有机氮源对细胞的早期生长有利， 氨基酸的加入 主要是为了代替或增加氮源的供 应。
? 但注意苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸可通过灭活位 于叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮 的利用，而精氨酸通常具有补偿此灭活作用的 能力。
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5 、维生素
植物细胞培养的技术
闫超 姜玮 马可
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植物细胞培养的技术 ? 一、植物材料的准备 ? 二、培养基制备 ? 三、培养方法选择
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一、植物材料的准备
用于植物组织培养的外植物必须是 无菌材料 ， 因此培养前必须对外植物进行严格的灭菌处理。 如果含有其他微生物，在培养基中，其他微生 物会大量迅速繁殖从而影响植物组织的培养。