【CN109988820A】一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910317012.X

(22)申请日 2019.04.19

(71)申请人 奥明（杭州）基因科技有限公司

地址 310018 浙江省杭州市江干区杭州经

济技术开发区白杨街道6号大街452号

2幢A1711-A1712号房

(72)发明人 童云广　王瓯晨　徐鹭芹　

(74)专利代理机构 杭州知见专利代理有限公司

33295

代理人 赵越剑

(51)Int.Cl.

C12Q 1/6806(2018.01)

C12Q 1/6886(2018.01)

C40B 50/06(2006.01)

C12N 15/11(2006.01)

(54)发明名称

一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方

法及试剂盒

(57)摘要

本发明公开了一种用于乳腺癌多基因检测

的文库构建方法及试剂盒，包括(1)样品采集与

提取；(2)末端修复/磷酸化/加A；(3)添加含标签

的接头序列；(4)捕获前扩增；(5)目的基因杂交

捕获；(6)富集；(7)捕获后扩增。本发明基于二代

数字分子标识符(DMI )和双链双标签双重纠错

(DSDC)技术，可有效降低深度测序PCR扩增或测

序中发生的错误，提高检测灵敏度，同时针对反

应体系和杂交洗涤液进行了优化，能对目标基因

进行有效富集，降低样本量的要求。可用于乳腺

癌的靶向治疗、临床试验以及疗效评估涉及基因

检测的技术领域。权利要求书3页 说明书14页序列表6页 附图2页CN 109988820 A 2019.07.09

C N 109988820

A

权　利　要　求　书1/3页CN 109988820 A

1.一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)样品采集与提取：收集外周血，分离血浆，并提取游离核酸DNA；

(2)末端修复/磷酸化/加A：对提取到的游离核酸DNA进行末端修复、磷酸化及加A；

(3)添加含标签的接头序列：将步骤(2)处理后的游离核酸DNA与含标签的接头序列混合，PCR反应，纯化后得标签-靶标DNA；

(4)捕获前扩增：对标签-靶标DNA进行PCR扩增，然后进行纯化，获得基因组DNA文库；

(5)目的基因杂交捕获：使用Hyb Block将基因组DNA文库进行杂交前的封闭，然后使用捕获探针与基因组DNA文库进行杂交捕获；

(6)富集：对步骤(5)捕获到的靶序列采用磁珠富集法进行富集；

(7)捕获后扩增：对步骤(6)富集后的靶序列进行PCR扩增，纯化后获得目的基因文库。

2.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：含标签的接头序列为：

正链：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCNNNNNNNNNNNNGATCT；

负链：

/5phos/GATCNNNNNNNNNNNNGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC；

其中，NNNNNNNNNNNN是长度为3～15nt的标签序列，N为A、G、C或T；负链中的标签序列与正链中的标签序列反向互补。

3.根据权利要求2所述的文库构建方法，其特征在于：正链中的标签序列具体包括SEQ ID No.1—SEQ ID No.25所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：步骤(4)捕获前扩增的PCR扩增引物序列如下：

上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAG

下游引物：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC。

5.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：所述Hyb Block的序列为：SEQ ID No.26和SEQ ID No.27。

6.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：步骤(5)中，用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液组成为：0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，5～8％硫酸葡萄糖，无核酸酶水余量。

7.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：步骤(5)的捕获探针经生物素标记，步骤(6)中磁珠富集法的磁珠为链霉亲和素偶联的磁珠，磁珠富集法采用的清洗液包括清洗液I和清洗液II，清洗液I组分为：0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠，0.5％十二烷基硫酸钠，1％氯化镁，无核酸酶水余量；清洗液II组分为：0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，无核酸酶水余量。

8.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：步骤(7)捕获后扩增的PCR扩增引物如下：

通用引物P1：A A T G A T A C G G C G A C C A C C G A G和

Index引物：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC，NNNNNNNNNNNN 是长度为3～15nt的标签序列，N为A、G、C或T。

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