侵袭性真菌感染血清学诊断方法

• 下列情况可出现假阳性： • （1）使用使用半合成青霉素尤其是哌拉西林/他 唑巴坦； • （2）新生儿和儿童； • （3）血液透析； • （4）自身免疫性肝炎等； • （5）食用可能含有GM的牛奶等高蛋白食物和污 染的大米等。
临床常见侵袭性真菌感染概况
• 深部真菌感染（ deep fungal infection ，DFI） • 也称为侵袭性真菌感染（Invasive fungal infection, IFI)。 • 可由致病真菌或条件致病真菌引起。
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临床常见侵袭性真菌感染危险因素
1,3-β-D-葡聚糖检测(G试验)原理
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目前市售检测试剂盒
• 一、Fungitec-G(日本Seikagaku Kogyo公司） 试剂成分：东方鲎的细胞裂解产物 判定标准：20pg/ml • 二、Glucatell（美国Cape Code协会） 试剂成分：美洲鲎的细胞裂解产物 判定标准：60pg/ml 2003年获得美国FDA批准 • 三、 北京金山川公司 判定标准：20pg/ml
G试验临床应用
• 1、帮助早期诊断IFI。可检测真菌包括：念珠菌、曲霉、 肺孢子菌、镰刀菌、地霉、组织胞浆菌、毛孢子菌等。不 能区别感染真菌的种类。 • 2、用于动态随访疾病的变化，用来判断药物的疗效，提 2 用于动态随访疾病的变化 用来判断药物的疗效 提 示疾病的发展和预后。 • 3、不能用于检测隐球菌和接合菌感染。
病原菌（株数）
凝固酶阴性葡萄球菌（1524） 金黄色葡萄球菌（787） 肠球菌属（553） 念珠菌属（379） 大肠埃希菌(303) 克雷伯菌属(252) 假单胞菌属（235） 肠杆菌属（230） 链球菌（139） 沙雷菌（67） 4725
占有率（%）
32.3 16.7 11.7 8.0 64 6.4 5.3 5.0 4.9 2.9 1.4
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临床常见侵袭性真菌感染概况
• 念珠菌引起的血流感染中白色念珠菌仍排第1位，但所占 比率下降，非白色念珠菌感染率有明显上升。尤其是光滑 念珠菌和近平滑念珠菌。 • 在我国，侵袭性真菌感染也日益增多，在院内感染中已占 重要地位，在上世纪80年代以前，血培养阳性检出菌中， 真菌约只占病原菌的2％，而近年来上升为15％左右，其 中主要是念珠菌。 • 长期大量应用免疫抑制剂的器官移植受者新生隐球菌感染 率可达10%-30%。HIV患者中感染率10%-25%。
MB-80标准型
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检测步骤

操作注意事项
预热采集
• 在进行试验之前，仪器一定要提前预热30min，达到工作温度后，按要求 填写表头信息，完毕后点击采集，使仪器处于采集状态后再进行试验。
样本预处理
• 1. 血液标本3000r/min离心1min。 2 取富含血小板血浆（离心后上清液的中部）。 • 2. • 3. 70℃加热时间严格控制在10-12min。 • 4. 样本处理液加热冷却(冰水)5-10分钟后，不要震荡、摇晃以免将处 理过的下层干扰物质悬浮上来。 • 5. 取处理液的上清液。 • 6. 加入主剂200μL液体要全部转移至平底试管，转移过程中不能出现 气泡。平底试管要一次插到底，插入后不要再碰触或移动。
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GM试验简介 GM 试验简介
• 检测意义：
– 主要适于侵袭性曲霉菌感染的早期诊断。该试验结果 已在欧洲癌症治疗研究组织/真菌病研究组（EORTC/MSG） 关于IFD诊断中，作为IA临床诊断的微生物学标准之一。
– 抗真菌治疗疗效的监测和评估。 抗真菌治疗疗效的监测和评估 • 推荐检测频率： – 对高危患者1周检测2次，以连续2次阳性为阳 性标准。
• • • • • • • • • 免疫功能重度低下、AIDS 血液透析、急性肾衰竭、器官移植 中性粒细胞减少症 长期接受广谱抗生素治疗、类固醇激素应用 静脉置管、糖尿病 烧伤、延长住院时间（ICU病房） 心脏外科手术（如心瓣膜修复术） 胃肠外供给高营养成分 静脉吸毒等
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引起侵袭性感染的真菌
• • • • • • 念珠菌 隐球菌 曲霉菌 镰刀菌 赛多孢菌 接合菌（毛霉目、虫 霉目） • 卡氏肺孢子菌
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注意假阳性问题
• 以下情况可出现假阳性： • （1）使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或 其他含有葡聚糖的材料； • （2）静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制 品； • （3）链球菌血症； • （4）操作者处理标本时存在污染。另外，使用多糖类抗 癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食物中的葡聚糖或定 植的念珠菌经胃肠道进入血液等也可能造成假阳性。
1,3--D-葡聚糖
1、对热极为稳定，高压121℃并不能使其灭活。 2、当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬 、消化等处理后，1,3-β-D-葡聚糖可从胞壁中释放出来 ，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌在体内含量 减少时，机体免疫系统可将其清除。 3、在浅部真菌感染中，1,3-β-D-葡聚糖未被释放出来，故 其在体液中的量不增高。
主要内容
侵袭性真菌感染血清学诊断方法
• 临床常见侵袭性真菌感染概况
孙长贵 解放军第一一七医院检验科 南京军区医学检验质控中心
• 侵袭性真菌感染血清学诊断方法
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临床常见侵袭性真菌感染概况
• 真菌隶属于真核域（Domain Eukarya），真 菌界（Kingdom Fungi）。 • 其种类繁多，自然界估计有多达150万种真 菌，目前被识别和描述的真菌大约有10万 种，然而与人类和动物疾病有关的约500种， 能引起正常个体感染的致病真菌则在50种 左右。
临床上较常见系统性真菌病
• 念珠菌病: 最常见，占血源感染的第4位。 • 曲霉菌病: 血液系统恶性肿瘤病人发病 可达30%，器官移植常见合并症。 • 隐球菌病: 在艾滋病人发病率为10-20% 。 • 接合菌病: 多见于糖尿病和烧伤病人。
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美国SCOPE调查院内血流感染排前10位细菌
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侵袭性真菌感染发生率
• 实体器官移植
– – – – – 肾脏 心脏 心脏-肺/肺 胰腺 肝脏
侵袭性真菌感染死亡率
• 我国2007年版《重症患者侵袭性真菌感染诊断与 治疗指南》指出，侵袭性念珠菌感染的死亡率达 30%～60%，而念珠菌血症的死亡率甚至高达 40%～75%，其中光滑念珠菌和热带念珠菌感染的 死亡率明显高于白色念珠菌等其他念珠菌。 • 在肝、肺、心脏移植和骨髓移植受者中，侵袭性 曲霉感染的病死率：70％~90％。 • 非HIV感染者隐球菌脑膜炎死亡率0%~47%。 • 免疫缺陷患者并发接合菌病总体病死率高达70％ ~100％。
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临床常见侵袭性真菌感染概况
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临床常见侵袭性真菌感染概况
• 在临床医学中，致病真菌感染按其侵犯部位不同， 习惯将其分为浅部和深部真菌感染两类： • 浅部真菌感染指真菌主要侵犯机体皮肤、毛发和 指（趾）甲，寄生和腐生于表皮、毛发和甲板的 角质组织中，引起浅部真菌病。 • 深部真菌感染指真菌侵犯皮下组织、黏膜、肌肉、 内脏器官和中枢神经系统，引起全身性感染的深 部真菌病。
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5 - 42%
5 – 14% 5 – 32% 15 – 36% 18 – 38% 7 – 42 %
• 骨髓移植 15 ‐ 25% • ICU 17% • 艾滋病患者病程中发生真菌感染的可能性大 于80％
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侵袭性真菌感染目前存在的问题
发病率上升 少见的真菌感染增多（根霉、毛霉、镰刀菌等） 念珠菌属中非白念株增多，耐药程度高 诊断困难、漏诊情况严重 治疗困难、预后差、病死率高 预防困难。
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• 双相真菌： 申克孢子丝菌 马尔尼菲青霉菌 荚膜组织胞浆菌 粗球孢子菌 巴西副球孢子菌 皮炎芽生菌。
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深部真菌病：
系统性真菌病： • 念珠菌病 • 曲霉病 • 隐球菌病 • 接合菌病 • 双相真菌感染 皮下真菌病： • 孢子丝菌病 • 着色芽生菌病 • 暗色丝孢霉病 • 足菌肿
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GM试验的局限性 •
有一定的假阳性率和假阴性率。 – 阴性结果不能排除IA的诊断，对高危病人应1周检测2次。 – 阳性结果不能确定就是IA， ，还需结合临床症状及其他诊 断方法如微生物培养、组织病理学检查及影像学检查的 结果综合判断。 – 在血浆、BAL、CSF等样本中还充分的评估。
chitin ergosterol
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1,3-β-D-葡聚糖检测(G试验)原理
• 鲎试剂（鲎变形细胞溶解产物提取物G因子）能与 细菌的内毒素发生反应，也可与1,3-ß-D-葡聚糖 发生反应。 • 用非离子性表面活性剂和多粘菌素B的前处理液抑 制标本中的内毒素活性，1,3-ß-D-葡聚糖与鲎试 剂（G因子）发生反应，形成凝固蛋白。根据其引 起的浊度变化对1,3‐β‐D 葡聚糖浓度进行定量检测
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Jul 1998 1998-May 2000 中国前6位的念珠菌
菌名 白念珠菌 热带念珠菌 光滑念珠菌 近平滑念珠菌 季也蒙念珠菌 克柔念珠菌 其它 株数 228 79 22 21 7 5 12 ％ 61 21 6 6 2 1 3
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G试验建议
• • • • 1、与GM试验联合检测可提高阳性率。 2、2次或2次以上阳性可降低假阳性率。 3、高危患者建议每周检测1‐2次。 4、高危人群动态监测。
半乳甘露聚糖抗原检测 （GM试验）
• 曲霉菌特有的细胞壁多糖成分是β（1，5）呋喃半 乳糖残基，菌丝生长时，半乳甘露聚糖（GM）从 薄弱的菌丝顶端释放 是最早释放的抗原 GM释 薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的抗原。 放量与菌量成正比，可以反映感染程度。
• 深部真菌感染的疗效及转归很大程度上取决于： “早期诊断、早期规范治疗”
早期诊断尤为重要
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侵袭性真菌感染的诊断方法
传统诊断方法 —真菌直接镜检 —真菌培养及培养物的鉴定
(阳性率低 周期长 (阳性率低、周期长）
侵袭性真菌感染的血清学诊断
非培养诊断方法 —组织病理学 __影像学 __血清学 __分子生物学
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GM试验简介 GM 试验简介
• 酶免法试剂盒： – PLATELIATM ASPERGILLUS EIA（BIO-RAD） • 原理： – GM试验是以大鼠单克隆抗体EBA-2作为包被抗 体和检测抗体，通过双抗体夹心法来检测曲霉 细胞壁抗原半乳甘露聚糖（GM），检测限为 1ng/ml。 • 标本的类型： – 血浆、血清、Bal、CSF 等。
侵袭性真菌细胞壁成分和抗原检测
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1,3-β-D-葡聚糖检测(G试验)
• 1,3--D-葡聚糖(BG)广泛存在于真菌细胞壁中, 占真菌细胞壁成分50%以上，是真菌细胞壁上的特 有成分。 • 其他微生物、动物及人的细胞不含该成分。
mannoproteins t i 1,3 1,6 glucans PPL bilayer 1,3 glucan synthase
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侵袭真菌感染血清学诊断
• 血清学诊断主要包括细胞壁成分、抗原、代谢产 物及抗体检测。 • 其中真菌抗原和代谢物成分的检测敏感性高、特 异性好，能够反映病情的变化，对于免疫功能受 损的患者更有价值，已应用于隐球菌病、曲霉病、 念珠菌病及组织胞浆菌病的诊断。
临床常见侵袭性真菌感染概况
• 自20世纪80年代以来，全身性真菌感染呈上升趋势。 国外报道每年念珠菌引起人群发病率为2/10万~10/10 万。在美国医院获得性血液感染中念珠菌排在第4位 • 调查显示白色念珠菌菌血症数约占医院血流感染病人 的6％～15％。
排 位
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 菌株总数