6 原生质体融合育种

原生质体活力鉴定方法主要有： （注意区别）
✓ ①荧光素双醋酸盐染色法 ✓ ②酚藏花红染色法 ✓ ③伊文思蓝染色法
①荧光素双醋酸盐（FDA）染色法
➢ FDA本身不发荧光，被细胞吸收脂解后产生具有荧光 的物质。能发出荧光的原生质体具有活性；（吸收-代 谢-呈色）
②酚藏花红染色法
➢活性原生质体能吸收酚 藏花红染料而成红色，无 活性的死细胞不能吸收染 料呈白色;（吸收-呈色）
原生质体必须重新合成细胞壁物质，恢复至完整细胞形态， 才能进一步生长、分裂和增殖，这一过程就是原生质体的 再生。
影响原生质体再生的因素（略）
菌体生理状态 稳定剂 酶浓度与酶作用时间 再生培养基的组成 原生质体的密度
……
三、原生质体融合
（一）融合剂和融合手段
化学融合剂，普遍采用PEG介导的化学融合法。
灭活法的不足之处：菌丝碎片或未酶解的完整细胞具有更 强的抗性，在选择培养基会优先形成菌落，从而抑制融合 体生长。
4.利用荧光染色法选择融合体
荧光染色法是事先使双亲染色而携带不同荧光色 素标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑 取同时带有双亲原生质体荧光标记的融合体。
5.利用双亲对碳源利用不同而检出融合体
物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状 机会更大。
不足之处
➢ 原生质体融合后DNA交换和重组随机发生，增加 重组体分离筛选的难度。
➢ 细胞对异体遗传物质的降解和排斥作用，以及遗 传物质非同源性等因素也会影响原生质体融合的 重组频率，使远缘融合杂交存在较大困难。
第3节 原生质体融合育种的步骤
一、直接亲本及其遗传标记的选择 二、原生质体制备与再生 三、原生质体融合 四、融合体再生与检出 五、重组体检出鉴别与遗传特性分析
✓ P在EPPEGGE介G法导法 融原合原时生，生通质常质需体要体的 一定的融浓度融合的C合图a2+和图示Mg示2+，能更有效地 促进融合。
（一）融合剂和融合手段
物理融合手段，电融合
✓ 细胞产生偶极化，原生质体相互粘连，细胞沿电力方向排列成串； ✓ 在外加瞬间高频直流强电压作用下，扰乱原生质体膜的分子排列，
Microbe B
ADD ENZYME
Microbe A
ADD FUSION PROMOTER
原生质体融合
融合后再生
原 生 质 体 融 合 后 基 因 重 组
与常规杂交相比，原生质体融合具有多方面的优势
➢ 大幅度提高亲本之间重组频率。 ➢ 扩大重组的亲本范围。 ➢ 原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传
四、融合体再生与检出
（一）融合体再生
融合体的再生，包括融合体细胞壁合成、重建和融合体的 再生。
原生质体复原后，细胞的生理和生物学特性可恢复正常状 态。但一些质粒可能会脱落。
（二）融合体的检出与分离
A
B
1. 利用营养缺陷型标记选择融合体
2. 利用抗药性选择融合体
3. 利用灭活原生质体检出融合体 A A
利用亲株对各种碳源利用差异，结合其他特性分 离筛选融合体。
不利用木糖，抗放线菌酮
能利用木糖，对放线菌酮敏感
含有木糖和放线菌酮的选择培养基上检出融合体
6．融合体的其他选择方法
①利用某些微生物对昆虫的毒力进行选择（略）； ②通过形态差异进行融合体选择。这一方法首先要求所采用的菌株具
有可供肉眼直接观察的形态学差异； ③通过生化测定指标选择融合体。通常测定的生化项目有DNA含量、
Protoplast fusion allows genetic improvement (random mutation & recombination) of asexual micro-organisms
protoplasts preparation: cells are grown in isotonic solution while
A
融合体 B
2.利用抗药性选择ห้องสมุดไป่ตู้合体
微生物的抗药性是菌种的重要特性。不同种的微生物对某 一种药物的抗性存在差异。
应用此法要注意药物的浓度，过高会使融合频率降低，过
低则会使亲本生长，影响融合体的检出。
Ampr A
AmprKanr
Kanr B
融合体
3.利用灭活原生质体检出融合体
产朊假丝酵母原生质体与酿酒酵母原生质体融合时，用碘 乙酸使产朊假丝酵母原生质体灭活，然后双亲原生质体融 合，利用形态差异选择融合体。
第4节 基因组改组育种
基因组改组=诱变育种+多亲本递推原生质体融合 多亲本递推原生质体融合的特点：
① 多个带有不同遗传性状的亲本，一般4-11个亲本； ② 递推式：融合重组后代可重复进行第二轮、第三轮，
甚至更多轮融合。
Genome Shuffling
E. coli K12
Why genome shuffling?
不能克服远源杂交不亲和的障碍。
微生物杂交的方式
原核： 接合 原生质体融合
真核： 有性杂交 准性杂交 原生质体融合
第2节 原生质体融合育种
原生质体:脱去细胞壁的植物、真菌或细菌 细胞。
原生质体融合
原生质体融合（protoplast fusion）是20世纪70年代发展起 来的育种技术。
用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍—细胞壁，制成由 原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法， 诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、 重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一 体的稳定融合子。
3.原生质体的收集和纯化
纯化方法有以下几种（这些方法基于什么原理？）
✓ (1)过滤法 ✓ (2)密度梯度离心法 ✓ (3)界面法 ✓ (4)漂浮法
通常采用离心法。
(1)过滤法
根据细胞大小，选用孔 径略小于细胞的砂芯漏 斗，过滤。
原生质体由于外层细胞 膜柔软可变形，可以由 比它小的微孔中穿过， 而未酶解细胞或细胞团 却不能。
第6章 原生质体融合育种
本节重点
原生质体融合亲本及其遗传标记的选择 原生质体制备 原生质体融合 检出融合体的方法
本节难点
融合体和重组体的检出及鉴别的方法 提高重组效率的方法
第1节 微生物杂交育种
• 概念：杂交育种通过微生物杂交将不同菌 株的遗传物质进行交换、重组，使不同菌 株的优良特性集中于一个重组体中。
使之穿孔，然后发生原生质体膜复原过程，原生质体发生融合。
电融合法原生质体的
电场作用下原生质膜被击穿的过程 原生质体成串（40×） 原生
电融合法原生质体的融合结果
原生质体成串（40×） 原生质体融合（图1）
（二）原生质体融合过程
在高渗稳定液中，两个或两个以上凝聚成团，相邻原生质 体紧密接触的质膜面扩大，相互接触的质膜消失，细胞质 融合，形成一个异核体细胞；
(2)密度梯度离心法
用蔗糖或氯化铯等制成浓度 （密度）梯度溶液，由于密 原生质体 度差别，经离心后原生质体 漂浮于上部，未酶解细胞和 细胞碎片、 细胞碎片沉于溶液下部。 未酶解细胞
(3)界面法
原理：选两种不同浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原 生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。离心后 原生质体就集中在两层液面交界处而得到纯化。
AB
BB
4. 利用荧光染色法选择融合体
×
√
×
5. 利用双亲对碳源利用不同而检出融合
体
1．利用营养缺陷型标记选择融合体
融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，在基本培养基上只 有融合体生长而双亲本原生质体不能形成菌落。
此法较为准确可靠，缺点是易使部分表型延迟的融合体漏 选、工作量大，且营养缺陷型标记会使亲本的优良性状丧 失或降低。
异核体、杂合体以及重组体都能在选择培 养基上生长。
单倍体化
异核体
单倍体
繁殖传代
杂合体
单倍体
重组体常用的鉴别方法
菌体或孢子形态和大小的比较； DNA含量的测定比较； 同工酶电泳谱带的比较； 酶活性的测定； 代谢产物组成和产量的分析比较与测定； 对营养物质的利用以及超微结构的变化等。
一、直接亲本及其遗传标记的选择
➢ 原生质体融合的亲本应采用具有较大遗传 差异的近亲菌株，重组后的新个体具有更 大的杂种优势。
一、直接亲本及其遗传标记的选择
作为原生质体融合的二亲本菌株都应该带有一定的遗传标 记，便于重组体的检出。
常用遗传标记： （何谓“遗传标记”） ✓ 营养缺陷 ✓ 抗性 ✓ 热致死（灭活） ✓ 孢子颜色 ✓ 菌落形态
氨基酸含量、酸性磷酸酶、同工酶电泳等。 ➢ 实际应用中往往是将上述这些方法结合使用。如将营养缺陷型与抗药
性，抗药性与原生质体灭活等相结合选择融合体。融合体检出后，还 要结合一些生化分析方法对其进一步鉴定。
五、重组体检出鉴别与遗传特性分析
双亲融合后形成的融合体不等于重组体， 而可能是异核体或杂合二倍体。异核体细 胞在繁殖过程中发生核的融合，形成杂合 二倍体，通过染色体交换，产生各种重组 体。（异核体-杂合二倍体-重组体）
原生质体
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
(4)漂浮法
适用于一些细胞较大的微生物。 原生质体与细胞比重不同，原生质体的比重小于细胞，能
在一定浓度的溶液中漂浮在液面上，从而得到纯化。
4.原生质体的活力鉴定
分离纯化后的原生质体，用作再生或融合等育种的出发材 料，必须具有活力及再生能力，因此需要进行活力鉴定。
传统诱变育种与基因组改组育种比较
Y. Zhang, et al. 2002. Nature (415): 644-646.
Four multiple auxotrophes of Streptomyces (“one-marker”)
phenotype Arg Cys Pro Ura “marker” (prototrophy)
甲
生长快、产量低
乙 生长慢、产量高
杂交
生长快、产量高
应用
面包酵母:对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生 CO2 多，生长快；
酒精酵母:产酒率高，而对麦芽糖、葡萄糖的发酵 力弱
杂交:就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体
用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。
杂交育种的优点：
a) 可将两个或多个优良性状集中在一个个体上。 b) 由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因
此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大 步。 c) 利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后 所出现的产量上升缓慢的现象。 d) 杂交育种有助于总结遗传物质的转移和传递规律，丰富和促进 遗传学理论的发展。
杂交育种缺陷：
a) 只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因； b) 杂交进程缓慢，过程繁琐，育种时间长； c) 只能进行本物种或亲缘关系较近的物种杂交，
③伊文思蓝染色法
➢ 活性原生质体不吸附 染料为无色，死的无 活性细胞吸附染料呈 蓝色。 （不吸收-呈 色）
5.原生质体的保存
原生质体新鲜程度与其活性有关。 如果不是立即使用，则必须在低温下保存。但是
保藏时间很短。
（二）原生质体再生
原生质体融合试验之前必须摸索出最佳的再生条件和完成 再生实验，为融合体再生和复原做好准备。
二、原生质体制备与再生
（一）原生质体制备
制备大量具有活性的原生质体是微生物原 生质体融合育种的前提。
1.原生质体制备方法
机械法、非酶分离法和酶法。 采用前两种方法制备的原生质体效果差，
活性低，仅适用于某些特定菌株。 最有效和最常用的是酶法。该法时间短，
效果好。
Protoplast fusion
热致死（灭活）
A
B
把双亲中任何一方的原生质体用热灭
活（如50℃，2h或60℃，5 min)或用
灭活
正常活性
紫外线、药物灭活，使细胞内的某些
酶或代谢途径钝化（核酸不变性），
然后和另一方具有正常活性的原生质
体融合而获得重组体。
采用灭活标记融合频率较低，但重组
无活性 正常活性 正常活性
体产量较高。
inhibiting growth of cell wall, and partly dissociation it (lysozyme)
2.原生质体的鉴定
➢ (1)低渗爆破法：直接在显微镜下观察原生质体在 低渗溶液中吸水膨胀、破裂的过程。
2.原生质体的鉴定
➢ (2)荧光染色法：原生质体混悬液用荧光增白剂（VBL）染 色，洗涤后在荧光显微镜下观察，发出红色光则为完全原 生质体，发出绿色光则表明还有细胞壁成分存在。 （区别 细胞壁与细胞膜的不同）