脾脏淋巴细胞分离方法

小鼠脾脏淋巴细胞分离方法

需要提前准备的材料：

提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，

除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。

红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。

1、配制的percoll工作液：配制15 ml

100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。

2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml

70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用

60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用

50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用

40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用

30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用

20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用

找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。

3、小鼠脾脏细胞分离

（1）颈椎脱臼处死小鼠。75%酒精浸泡10min

（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。

（3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。

（5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min

（6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清

（7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。

（8）用注射器缓慢沿着事先准备好的梯度分离管中，水平离心1800-2000rpm 30-40min （9）收集想要的分层，用1xPBS洗3遍

（10）用完全RPMI-1640培养基混悬沉淀，（调成浓度为1×108/ml的细胞悬液）转入培养皿中，置37℃，5%CO2下孵育30min后（去除贴壁的细胞），收获未贴壁细胞

注：贴壁为单核细胞（巨噬细胞，树突细胞）

不贴壁的悬浮细胞（T/B/NK细胞）

附件1：

(一)原理

Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm／kg H２O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

(二)操作方法及注意事项

1.不同浓度(密度)Percoll溶液的制备: 先用9份Percoll与1份8.5％NaCl或1.5MPBS

混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。

Percoll浓度(％)706050403020

比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031

2.不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。

3.装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。

4.离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。

5.取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。

(三)分离纯化细胞举例

1.富含NK活性大颗粒淋巴细胞(LGL)的纯化:按顺序由下向上逐层加50％、47.5％、45％、4

2.5％和40％五种不同密度的Percoll,如用10ml试管(或塑料管)分离,每层Percoll 约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的PBMC细胞1×10８悬于１ml培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5％与45％Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。

2.纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50％和30％Percoll液。收取经PHA(或其它抗原、有丝分裂原)刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC(如肾综合征出血热患者)，按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。

密度方法计算:配70%percoll液: (70mlX1.123g/ml +30ml X 1.0046g/ml)/100ml=1.0875g/ml