碱裂解法小量提取质粒DNA
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碱裂解法小量提取质粒DNA
• 碱裂解法是较常用的质粒DNA提取方法。 其优点是收获率高，适于多数的菌株， 所得产物经纯化后可满足多数的DNA重 组操作。
实验原理
• 1. 溶液I: GTE 50mM葡萄糖：增加溶液的粘稠度，使悬浮 后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。 2. 25mM Tris-Cl（pH 8.0） 3. 10mM EDTA：是Ca2+和Mg2+等二价金属 离子的螯合剂，可抑制DNase的活性，并抑 制微生物生长。
实验原理
• 乙醇沉淀DNA
– 回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇， 在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。 – 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，乙醇可以 消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na离 子能与这些带电基团结合，在沉淀形成的部位降低多核苷酸 链之间的排斥作用，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。最 常用的盐是醋酸铵／氯化锂／氯化钠／醋酸钠。 – 沉淀体系如果盐浓度高，应在室温下沉淀。放到－20℃，时 间一长反而会导致大量盐的沉淀。 – 为了去除随DNA沉淀的盐，可用70%的乙醇洗涤沉淀。
实验步骤
1.
2. 3. 4. 5. 6. 7.
取1.5ml过夜培养菌置于1.5ml离心管中，于微量 离心机上以12000rpm离心1min。 弃上清液。 重复步骤1、2 。 短暂离心后，尽量吸干上清液。 沉淀中加100μl溶液I，充分悬浮沉淀（用移液体 器吹打悬浮或剧烈振荡）。 加入200μl溶液 II(新鲜配置)，加盖后缓慢颠倒 离心管6次混匀（千万不要振荡），室温防置不 超过5 min 。 加入150μl预冷溶液III，缓慢颠倒6次混匀，置 于冰浴15 min 。
2. 1% SDS（十二烷基磺酸钠）：是一种阴离子表 面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些 蛋白质变性。
第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下DNA片断 会慢慢断裂； 第二，混合必须轻柔，不然DNA也会断裂。
实验原理
• 溶液III：醋酸钾溶液，Ph4.8
–
–
–
当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值 恢复较低的近中性水平时， 质粒的两条小分子单链可迅 速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。 SDS遇到钾离子后变成十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶于水的，而高浓 度的盐使得沉淀更完全。SDS极易和蛋白质结合，平均 两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生 的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。 同时，尽管SDS并不与DNA分子结合，由于大肠杆菌的 基因组DNA很长，很容易和变性的蛋白质缠绕在一起。 在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，变性蛋白质等 缠绕一起被沉淀，而复性的质粒DNA以可溶性状态留在 上清夜中。
实验步骤
8. 9. 10. 11. 微量离心机上以4℃，12000rpm离心10min。 将上清液转移到另一新的1.5ml离心管中。 加入等体积酚/氯仿（1：1），震荡1min。 12000rpm,离心5min。
12. 小心转移上层溶液至一新的离心管，弃去中层的 蛋白质和下层的有机相。 13. 加入等体积氯仿，震荡1min 。 14. 12000rpm,离心5min。
实验原理
• 酚/氯仿抽提
– 可以通过酚、氯仿抽提去除残留的蛋白质。酚和氯仿都 是蛋白质的变性剂，但酚的变性作用要远大于氯仿。 – 由于酚能溶解10%-15%的水，因此在使用前要用Tris溶 液饱和。以免减少抽提过程中DNA溶液的损失。 – 水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心 后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；氯仿 和酚可以互溶，加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿 始终在下层，方便水相的回收。 – 由于酚与水有很大的互溶性，用酚/氯仿抽提后会有少量 的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制 性酶切反应），用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。
一、请完成实验报告。报告内容： 1，课件中的全部实验原理及实验步骤 2，实验结果：包括实验现象、结果的记录及描 述。 3，实验分析：对实验现象及结果（包括实验经 验、心得）的分析、归纳。 二、请预习下周实验：聚合酶链式反应（ PCR）
源自文库验步骤
14. 小心转移上层溶液至一新的离心管，加入 2 倍体积100%乙 醇,混匀。 15. 室温放置15min。 16. 12000g×10min。 17. 去上清，用0.5ml70%乙醇淋洗沉淀(不要把沉淀悬浮起来)。 18. 12000g×30秒。 19. 尽量去上清。 20. 在室温下晾干沉淀。 21. 加入50μlTE缓冲液（PH 8.0，含20μg/mlRNaseA）溶解质 粒DNA 。 22. 80℃温育20min 。 23. -20℃保存。
实验原理
• DNA的溶解
– DNA沉淀经过70%的乙醇洗涤后，在实验台上敞 口放置一定时间，使残余乙醇挥发掉。当DNA沉 淀仍有些潮湿的时候，用适当缓冲液溶解便可溶得 快速而且完全。完全干燥的DNA沉淀溶解缓慢且 效率较低。 – 得到的质粒样品一般用含RNase（20 ug/ml）的 TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干 扰电泳结果的。
实验原理
• 溶液II: NaOH/SDS溶液 1. 0.2 N NaOH：是最佳的溶解细胞的试剂，不管 是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几 乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构 的相变化所导致。由于质粒和细菌染色体的拓扑 结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然 缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现 断裂。因此，在裂解细菌时要注意：
• 碱裂解法是较常用的质粒DNA提取方法。 其优点是收获率高，适于多数的菌株， 所得产物经纯化后可满足多数的DNA重 组操作。
实验原理
• 1. 溶液I: GTE 50mM葡萄糖：增加溶液的粘稠度，使悬浮 后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。 2. 25mM Tris-Cl（pH 8.0） 3. 10mM EDTA：是Ca2+和Mg2+等二价金属 离子的螯合剂，可抑制DNase的活性，并抑 制微生物生长。
实验原理
• 乙醇沉淀DNA
– 回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇， 在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。 – 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，乙醇可以 消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na离 子能与这些带电基团结合，在沉淀形成的部位降低多核苷酸 链之间的排斥作用，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。最 常用的盐是醋酸铵／氯化锂／氯化钠／醋酸钠。 – 沉淀体系如果盐浓度高，应在室温下沉淀。放到－20℃，时 间一长反而会导致大量盐的沉淀。 – 为了去除随DNA沉淀的盐，可用70%的乙醇洗涤沉淀。
实验步骤
1.
2. 3. 4. 5. 6. 7.
取1.5ml过夜培养菌置于1.5ml离心管中，于微量 离心机上以12000rpm离心1min。 弃上清液。 重复步骤1、2 。 短暂离心后，尽量吸干上清液。 沉淀中加100μl溶液I，充分悬浮沉淀（用移液体 器吹打悬浮或剧烈振荡）。 加入200μl溶液 II(新鲜配置)，加盖后缓慢颠倒 离心管6次混匀（千万不要振荡），室温防置不 超过5 min 。 加入150μl预冷溶液III，缓慢颠倒6次混匀，置 于冰浴15 min 。
2. 1% SDS（十二烷基磺酸钠）：是一种阴离子表 面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些 蛋白质变性。
第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下DNA片断 会慢慢断裂； 第二，混合必须轻柔，不然DNA也会断裂。
实验原理
• 溶液III：醋酸钾溶液，Ph4.8
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当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值 恢复较低的近中性水平时， 质粒的两条小分子单链可迅 速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。 SDS遇到钾离子后变成十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶于水的，而高浓 度的盐使得沉淀更完全。SDS极易和蛋白质结合，平均 两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生 的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。 同时，尽管SDS并不与DNA分子结合，由于大肠杆菌的 基因组DNA很长，很容易和变性的蛋白质缠绕在一起。 在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，变性蛋白质等 缠绕一起被沉淀，而复性的质粒DNA以可溶性状态留在 上清夜中。
实验步骤
8. 9. 10. 11. 微量离心机上以4℃，12000rpm离心10min。 将上清液转移到另一新的1.5ml离心管中。 加入等体积酚/氯仿（1：1），震荡1min。 12000rpm,离心5min。
12. 小心转移上层溶液至一新的离心管，弃去中层的 蛋白质和下层的有机相。 13. 加入等体积氯仿，震荡1min 。 14. 12000rpm,离心5min。
实验原理
• 酚/氯仿抽提
– 可以通过酚、氯仿抽提去除残留的蛋白质。酚和氯仿都 是蛋白质的变性剂，但酚的变性作用要远大于氯仿。 – 由于酚能溶解10%-15%的水，因此在使用前要用Tris溶 液饱和。以免减少抽提过程中DNA溶液的损失。 – 水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心 后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；氯仿 和酚可以互溶，加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿 始终在下层，方便水相的回收。 – 由于酚与水有很大的互溶性，用酚/氯仿抽提后会有少量 的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制 性酶切反应），用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。
一、请完成实验报告。报告内容： 1，课件中的全部实验原理及实验步骤 2，实验结果：包括实验现象、结果的记录及描 述。 3，实验分析：对实验现象及结果（包括实验经 验、心得）的分析、归纳。 二、请预习下周实验：聚合酶链式反应（ PCR）
源自文库验步骤
14. 小心转移上层溶液至一新的离心管，加入 2 倍体积100%乙 醇,混匀。 15. 室温放置15min。 16. 12000g×10min。 17. 去上清，用0.5ml70%乙醇淋洗沉淀(不要把沉淀悬浮起来)。 18. 12000g×30秒。 19. 尽量去上清。 20. 在室温下晾干沉淀。 21. 加入50μlTE缓冲液（PH 8.0，含20μg/mlRNaseA）溶解质 粒DNA 。 22. 80℃温育20min 。 23. -20℃保存。
实验原理
• DNA的溶解
– DNA沉淀经过70%的乙醇洗涤后，在实验台上敞 口放置一定时间，使残余乙醇挥发掉。当DNA沉 淀仍有些潮湿的时候，用适当缓冲液溶解便可溶得 快速而且完全。完全干燥的DNA沉淀溶解缓慢且 效率较低。 – 得到的质粒样品一般用含RNase（20 ug/ml）的 TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干 扰电泳结果的。
实验原理
• 溶液II: NaOH/SDS溶液 1. 0.2 N NaOH：是最佳的溶解细胞的试剂，不管 是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几 乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构 的相变化所导致。由于质粒和细菌染色体的拓扑 结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然 缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现 断裂。因此，在裂解细菌时要注意：