色谱分类及应用领域

洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动 相体积，为洗脱体积
Ve Vm K dVs
不同的溶质，由于和固定相的亲和力的 不同，洗脱体积也有所差异。
理论板，理论板当量高度（HETP），理论塔板数 （N）、 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度 与柱高之间的关系。 理论板：将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段。 理论板当量高度：该段色谱柱的高度。
按分离的压力 高压色谱 中压色谱 低压色谱 按流动相分 气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱

22.3

各类色谱技术及应用




凝胶过滤色谱 离子交换色谱 疏水色谱 聚焦色谱 反相色谱 超临界流体色谱 羟基磷灰石色谱 灌注色谱 应用
凝胶过滤技术
1)Gel filtration chromatography(GFC)原理 操作与原理：含有不同组分的溶液， 通过网状结构的凝胶粒子(a)， 小分子扩散进入凝胶相，大分 子被排阻于凝胶相外，加入洗 脱剂后溶液向下推移，大分子 及剩余的小分子进入下层新的 凝胶相中，重复上述扩散和排 阻。这样最先流出的为最大的 分子，最后流出的为最小分子， 分段收集可以获得按分子量大 小分布的各组分。 分子筛色谱 : 从上可见，凝胶过滤 具有分子筛的作用。
两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值.

阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速 度和标准物（与固定相没有亲和力的流 动相 Kd=0）的迁移率之比
溶质的迁移距离 Rf 流动相在色谱系统中的迁移距离
Am Rf Am K d As
其意义在于体现某一种溶质与固定相之间 的亲和力大小.
凝胶介质特征参数 排阻极限 (exclusion limit) ：指不能扩散到凝胶 网络内部的最小分子的 M 。如， Sephadex G50 的 排阻极限为30kD。 分级范围 (fractionation range) ：能阻滞组分并 且使组分相互之间得到分离的组分分子量范围。 如， Sephadex G50的分级在1.5-30KD内。 溶胀率/吸水率：

按操作形式不同分类：
柱色谱：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动 而达到分离。 纸色谱：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展 开，以达到分离鉴定的目的。 薄层色谱：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸色谱 类似的方法进行物质的分离和鉴定。 纸色谱和薄层色谱主要适用于小分子物质的快速检 测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱 色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离。 生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色谱、亲和 色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱形式。
色谱法的基本原理

色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差 异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、 分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的， 称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相） 中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度 移动而达到分离的目的。
色谱分离
淋洗液
慢 中等 快
Temporal course
22.1色谱的基本概念

固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固 体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也 可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶 液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的 吸附，溶解，交换等作用。

流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的 物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为 流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时 称为展层剂。
分配系数m影响因素：分子量, 分子形状, gel孔 径结构；与pH, I, T无关.
2)凝胶介质 对介质的要求： 1st 亲水性高； 2nd 表面惰性，不发生化学和物理变化； 3rd 高稳定性，有较宽的pH和I适应范围； 4th 具有一定的孔径分布； 5th 机械强度高，耐高压操作，寿命长。 商品化的介质均能满足1-4条的要求。 介质的类型： 1st Sephadex 2nd Sephacryl 3rd Superose/-dex, Sepharose 4th Cellulose 5th TSKgel
22 液相色谱技术 Chromatography
背景


色谱法也称色层法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸 附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色 带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。 后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。 英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板 理论，以及其远见卓识的预言。 1944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层 色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱 （HPLC）等。
7）缺点

1st 分离仅限于分子量的差别，选择性低，处理量少； 2nd 经GFC洗脱后，产品被稀释。因此需浓缩单元操作。
离子交换色谱

以离子交换树脂作为固定相，选择合适的 溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换 亲合力的不同而得到分离的方法
原理 (ion exchanger chromatography, IEC) 1st 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数m
6）优点



1st 如其他色谱相比，操作简便，介质价廉易得；适合于 大规模生产； 2nd 溶质和介质不发生任何形式的相互作用，故操作条件 温和，回收率接近100%； 3rd 分离结束后，无须对分离介质进行清洗和再生，故容 易实施循环操作，提高产品纯度； 4th 作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超 滤相比，剪切力小，蛋白质的回收率高。 5th 分离机理简单，操作参数少，易于放大。

Starting material
Peak 2
SDS-PAGE
Mini Q PC 3.2/3: Glutathione synthetase
操作
1st 恒定洗脱(Sephadex常用)
缺点：洗脱体积大,溶质洗脱不尽
2nd 线性梯度洗脱(linear gradient elution)
线性梯度洗脱的优缺点
凝胶的粒径
1st dp, HETP.故dp是N的最佳途径； 2nd dp10倍, 而h和v不变，u10倍， HETP(=hdp) 10倍，R10倍
d u 2Dz mF H ( HETP) 2 u 30De 1 m F F 1
2 p
5）应用
1st 分离纯化

分配系数 可由Langmuir方程得出
q Kd c
Kd---分配系数 q、c---溶质在固相和液相中的浓度

保留时间（tR）和保留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱 过程的基本热力学参数之一。

分离度:又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线 相邻的溶质相互分离的程度。
2( R1 R 2 ) R W1 W2
分子量M和分配系数m
1st 在GFC分级范围内m与M关系
m a b log M
此时，分离度方程为
Rs 4 1 m1 F Ad p Bud / Dm
2 2 p

FL1 / 2 logM 1 M 2


0.5
b
方程示： b 值越大，即凝胶分级范 围越小，Rs越大。 2nd 因此，一定料液时，根据组分 的M选择分级范围较小的介质， 提高Rs和料液的处理量。
A m( I ) B m I
I-离子强度；A和B为常数, 均为pH的函数，在物理 意义上， B 为溶质的静电荷数与交换剂的离子价 数之比(对于pro,一般大于10)。m-离子强度无限 大时的溶质分配系数 , 为静电作用外的非特异性 吸附引起的溶质在交换剂上分配。 2nd 意义：对于pro.和aa 调节I value 调节|pH – pI| value
吸水率 W溶胀平衡后gel W干gel W干gel 100 %
如，Sephadex G50的溶胀率 = 500 ± 30%。
凝胶粒径：软gel粒径较大，在50-150m之间；硬 gel较小，在5-50m之间。粒径越小，HETP越小， 分离效率越高。 床体积(bed volume)：1g干燥gel溶胀后所占有的 体 积 。 如 ， Sephadex G50 的 床 体 积 为 9-11 cm3/g干胶。 空隙体积(void volume)：凝胶之间的空隙体积， 即 V 0。
V0 Vt
空隙体积一般用平均分子量在 2000KD 水溶性蓝葡 聚糖(blue dextran)测定。
4)影响GFC分离特性的因素
线速度： 1st HW40F 凝胶的排阻极限小，在 该凝胶中蛋白质的m = 0，故 HETP = 2Dz/u (Dz udp) = 常数。 2nd HW55F 凝胶的排阻极限较大， 在此， m > 0, HETP u; 在 u = 0处，直线交于点 2Dz/u。 3rd 当 u < 0.2 cm/min, NaCl 的 HETP 随流速降低急剧增大。这 主要由于分子的扩散影响。
M：x0-106， d: 0.x-x00nm之间； 种类：肽、脂质、抗生素、糖、核 酸、病毒(50-400nm)。
2nd 除热原、过敏原
如青霉噻唑蛋白 – Sephadex G25 凝胶柱。
3rd脱盐/置换buffer
4th M测定
原理：
m a b log M
挑 选 标 准 蛋 白 质 ： cyt C(12500), Mb(16900), 胰凝乳蛋白 (23200), 卵白蛋 白(45000)和Hb(64500). 条件：在凝胶介质分级范围内. 作图：
分子筛凝胶色谱原理
分离关系：组分0的M最大，不能进入gel，洗脱体 积为空隙体积V0；组分t的M最小，能进入到gel 的细孔中，其洗脱体积接近柱体积Vt, 组分1-2 在V0-Vt之间. 显然，GFC能分离洗脱体积在V0Vt之间的组分。对于组分1和2，两峰距离
V2 V1 Vt V0 m2 m1
Source 系列离子交换剂 特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反 压低 阳离子交换树脂 S系列 阴离子交换树脂 Q系列 MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia） 特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source 系列相同的优点，但动态载量更大，寿命 更长。 同样分为Q系列和P系列
常用的离子交换树脂

葡聚糖凝胶型
DEAE-Sephadex A-25，QAE-Байду номын сангаасephadex A-25，CMSephadex C-25，SP-Sephadex C-25


纤维素系列离子交换剂
DEAE-Sephacel Cellex系列
琼脂糖系列离子交换剂
Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂
优点：流动相I/pH 连续变化，不易出现干扰峰，操作范围广； 缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器。
3 rd 阶梯洗脱法(stepwise elution)
A H ( HETP) B Cu u
进样体积： 1st 在一定相对料液体积范围内 ， HETP为常数； 2nd 但一定时间之后， HETP 随料液相 对体积的增加而急剧增大。 3rd 意义：为得到较高的分离度，料 液体积需根据溶质的 m 差别控制在 适当的范围内，在不影响分离度的 前提下取最大值。 料液浓度 依据 GFC 的原理， tr 和 HETP 与浓度 无关。但实验表明，当浓度较高时， 洗脱曲线出现吐舌、拖尾、甚至双 峰；使HETP极度上升。这主要为样 品黏度高造成。经验表明，料液与 流动相的黏度比应控制在2以内。


理论板数的计算方法
tR 2 N 5.54( ) W1/ 2
tR 2 N 16( ) Wb
理论塔板高度：
N---理论塔板数 tR---保留时间 W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度
L H N
L---柱长
22.2 色谱分离方法的分类
色谱分离方法很多，种类有四、五十种 但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机 理分，有以下几种：