第八章 酶免疫技术

1、标记抗体免疫组织化学技术
第六节 其他酶免疫技术
其他酶免疫技术
免疫印记法（immunoblotting test）
其他酶免疫技术
生物素-亲和素（BSA）-酶联免疫吸附试验
生物素（biotin）-亲和素（avidin） 亲和素与生物素之间的亲和力极强，比抗原与抗体的 亲和力至少高1万倍，且具有高度特异性和稳定性。
虫剂） ➢ 食品中残留抗生素的检测（氯霉素、磺胺类、
呋喃类、喹诺酮类）
酶免疫测定的应用
ELISA在转基因食品检测中的应用（PCR-
ELISA方法） ➢ DNA检测 ➢ 蛋白质检测
思考题
1．酶免疫技术的要点？ 2．酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？ 3．竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？ 4．常用的底物有哪几类？特点？ 5．常用的酶有哪几类？特点？ 6．何谓包被与封闭？其作用？ 7．对酶免疫技术的应用评价如何？
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
➢ 分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试 验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定
第三节 酶联免疫吸附试验
ELISA
酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ）
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比
ELISA中应用最为广 泛的标记用酶
常用底物
HRP的底物
HR DH2+H2O2P→ → → D+2H2O
H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很 高（小分子醇和尿素的过氧化物）
鉴定
质量鉴定（ELISA法直接测定）
HRP标记IgG的酶标记率（戊二醛法） 酶结合量（mg/ml） IgG量（mg/ml） HRP/ IgG摩尔比 酶的标记率
四、最适工作浓度的选择(棋盘法)
10 ++ 1:1000
1.17
10 + 1:1000
0.15
10 1:1000
0.09
1.0 ++ 1:1000
（二）抗原和抗体 高纯度的Ag 高效价的Ab
一、试剂的准备
（三）酶和底物的选择 标记酶的要求：
活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β-D 半-乳糖苷 （ 4MUG ）
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计 测 量。
二、酶标记抗体或抗原的方法
酶免疫技术的核心组成部分
酶结合物 （conjugate）
酶标记物
通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的
结合物
制备方法要求
➢抗原要求纯度高，抗原性完整
第七节 酶免疫测定的应用
酶免疫测定的应用
ELISA在预防医学、临床医学的应用
➢ 病原体及其抗体的检测（乙肝两对半） ➢ 蛋白质的检测 ➢ 非肽类激素的检测 ➢ 药物的检测 ➢ 尿中毒品的检测
酶免疫测定的应用
ELISA在食品检测中的应用
➢ 食品中微生物的检测 ➢ 食品毒素的检测（黄曲霉毒素） ➢ 食品中残留农药的检测（除草剂、杀菌剂和杀
湿氏 推荐温度：37℃ 增强作用:聚乙二醇 反应时间:以阳性标本的吸光度值达到1.0时为反应终点
结果判定 1、吸光度法（A） 2、比例法(A/A0) 3、滴度法（倍比稀释样品） 4、吸光度直接表示阳性的程度（均一化） 5、标准曲线法
第五节 酶免疫组织化学技术
酶免疫组织化学技术(enzyme immunohistochemistry technique)
甲型肝炎HAV-IgM抗体
乙型肝炎病毒核心HBcIgM抗体
EE
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
+
捕获法原理
EE E
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中 应用最广泛的底物。
常用酶
碱性磷酸酶（ALP） β–半乳糖苷酶（β-Gal）
菌源性ALP 肠粘膜ALP(小
牛)
大肠埃希氏菌
常用底物
ALP的 底物
对-硝基苯磷酸酯 （ pNPP ）
经ALP作用后的产物为黄色 对硝基酚，最大吸收峰波长 为405 nm。
➢抗体需要特异性好、效价高、亲 合力强以及比活性较高，能批量生 产，易纯化。
制备方法
过碘酸钠法（直接法）
常用于HRP标记抗体或抗原
戊二醛交联法
戊二醛交联法
戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别 与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法 有一步法和二步法。二步法标记效率比一 步法高，酶标记物质量较均一。
均相酶免疫测定主要用于小分子物质和半抗原的测定，非均相 酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶 免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载 体的酶联免疫吸附试验（ELISA）,其原理可以有夹心法、竞争 法、间接法和捕获法等。
0.1 1:10000
0.12
0
0
0.22
0.01
0
0.03
0
0
五、测定方法的标准化
包被 加样 洗涤 孵育 结果判定
理想coating：吸附尽可能多的Ag或Ab；吸附牢 固；非特异性吸附较少
包被机制 1、物理性吸附（被动的） 2、共价交联（戊二醛，标准化）
影响包被的因素 1、包被物质的性质及其浓度 2、包被缓冲溶液的pH及离子强度 3、包被温度和时间
1.0 1:5000
0.01
0.1 ++ 1:5000
0.12
0.1 + 1:5000
0.04
0.1 1:5000
0.02
10 ++ 1:10000
10 + 1:10000
10 -1:10000
1.0
++ 1:10000
1.0 + 1:10000
1.0 1:10000
0.1
++ 1:10000
0.1 + 1:10000
Ag+Ab-E Ag-Ab-E+?
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶放大免疫测定技术EMIT
enzyme-mutiplied immunoassay technique
克隆酶供体免疫分析 CEDIA
cloned enzyme donor immunoassay
EMIT示意图
CEDIA示意图
二、异相酶免疫测定
目的 1、洗去未结合的物质 2、洗去非特异性吸附
要求 1、每孔充满液体 2、去净洗涤液（Tween20） 3、冲洗次数和浸泡时间足够 4、具有传染性样品必须采用全自动冲洗
孵育
定义：要使抗原抗体反应和酶催化反应顺利进行，需要合适的pH 和适当离子强度的基质液，保持一定的温度，并作用一定时间， 整个过程称为孵育或温育。 方法：干式
>2
1.0 + 1:1000
0.26
1.0 1:1000
0.12
0.1 ++ 1:1000
0.42
0.1 + 1:1000
0.14
0.1 1:1000
0.11
10 ++ 1:5000
0.46
10 + 1:5000
0.03
10 1:5000
0
1.0 ++ 1:5000
0.9
1.0 + 1:5000
0.12
➢ 应用：
二价或二价以上的较大分子抗原测定(乙型肝炎表面抗 原HBsAg),不能用于半抗原等小分子的测定。
E EE
E
E
E
E EE
+
双抗体夹心法测抗原 -
ELISA检测抗体的方法
捕获法
原理：
抗人IgMμ链抗体包被
捕获待测标本中IgM类抗体
加入特异性抗原和酶标记特 异性抗原的抗体
底物显色
应用：
病原体急性感染诊断中的 IgM型抗体
二、酶标记物的纯化和鉴定
纯化
标记完成后应除去反应液中的游离酶、 游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体 或抗原聚合物，避免游离酶增加非特 异显色，以及游离抗体或抗原起竞争 作用而降低特异性染色强度
常用的纯化方法： 葡聚糖凝胶（Sephadex）G-200/G150过柱层析纯化 50%饱和硫酸铵沉淀提纯 亲和层析效果更好（SPA-IgG;ConAHRP）
第一节 酶免疫技术的原理
原理及特点
抗原抗体反应的特异性
+
酶促催化反应的高敏感性
主要试剂: 酶标记的抗体或抗原
酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
原理及特点
原理：
➢酶标抗体（抗原）与抗原 （抗体）的特异性反应
➢酶对底物的显色反应
➢对抗原或抗体进行定位、 定性或定量的测定分析
特点：
➢灵敏度高、特异性强、 准确性好 ➢酶标记试剂能够较长时 间保持稳定 ➢操作简便、对环境没有 污染。 ➢易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的
三个部分： 免疫反应 酶与底物反应 检测方法的建立
高纯度的抗原、高亲和力的抗体 高活性、高纯度的标记用酶
有效的交联方法制备高质量的酶标记物 选用适宜的酶/底物系统
分离结合与游离标记物的方法 建立操作步骤以及研究自动化测定技术
一、基本原理
原理
1
包被
洗涤
3
使结合在固相上
的抗原抗体复合物
与未结合的分离
2
反应
加入待测抗体或
抗原和酶标抗原
或抗体
4 底物显色
定性或定量的分析
二、方法类型及反应原理
三个必要试剂
固相的抗原或抗体 酶标记物
酶反应的底物
ELISA检测抗原的方法
双抗体夹心法（double antibody sandwich-ELISA）
➢ 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，
加底物显色
定义
在一定条件下，应用酶标抗体或抗原与细胞或普通组 织切片中抗原或抗体反应，酶与底物作用形成有色沉淀 物或产物电子密度发生改变，在光镜和电镜下，就可识 别出标本中抗原或抗体的分布和性质；经图像分析也可 达到定量的目的。
种类
1、标记抗体免疫组织化学技术 2、Βιβλιοθήκη Baidu标记抗体酶免疫组织化学技术 3、酶标记免疫电镜技术
小结
酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗 体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应 完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。酶免疫技术 可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原 抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和 非均相两种类型。
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
4、加酶标抗体 无抗原结合， 加底物不显色
-
第四节 固相酶免疫测定的技术要点
试剂的准备 反应条件的选择 操作的标准化
一、试剂的准备
（一）固相载体 聚苯乙烯 特点：吸附蛋白能力强，保留其免疫活性 形状：小试管、小珠、微量ELISA板 使用前检测其性能
供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种
常用底物
四甲基联苯胺 TMB
邻苯二胺 OPD
HRP的常见底物
5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑 啉磺酸-6)铵盐 ABTS
HRP的常见底物
OPD反应后显橙 黄色，加酸终止 反应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
包被物质的性质及其浓度
聚苯乙烯吸附抗原效果好 聚乙烯吸附抗体效果好 浓度过高引起前带现象 浓度过低引起非特异性吸附(BSA封闭)
包被缓冲溶液的pH及离子强度
相对低的离子强度有利于蛋白质分子吸附固相表面
包被温度和时间
置4℃冰箱过夜，或37 ℃孵育2h
加样 加样量准确 加样位置 不产生气泡
洗涤
新方法。
第二节 酶免疫技术分类
酶
酶免疫组化 组织切片中的抗原抗体反应
免
疫
均相
技
术 酶免疫测定
液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
异相
固相酶免疫测定 (ELISA)
液相酶免疫测定
一、均相酶免疫测定
用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定
原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标
记酶的活性会发生改变，不用分离结合和 游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的 改变，而确定抗原或抗体的含量。
《免疫学检验》
吴倩 讲师 卫生检验系 公共卫生学院 南京医科大学 025-86862938 13921433351 wuqian@njmu.edu.cn
第八章 酶免疫技术
第一节 酶免疫技术的原理 第二节 酶免疫技术的分类 第三节 酶联免疫吸附试验 第四节 固相酶免疫测定的技术要点 第五节 酶免疫组织化学技术 第六节 其他酶免疫技术 第七节 酶免疫测定的应用